injektálható humán rekombináns kollagén mátrixok korlátozzák a kedvezőtlen átalakítás és javítja a szívműködést miokardiális infarktus után

tanulmány tervezés

itt végeztünk egy tanulmányt, hogy (I) tervezése klinikailag releváns kollagén hidrogélek segítségével rekombináns humán kollagének I. és III. típusú; (ii) jellemezze és hasonlítsa össze a fizikai tulajdonságait a rHCI és rHCIII anyagok; (iii) értékelje az anyagok terápiás potenciálját az MI kezelésére egerekben; és (iv) azonosítsa az rHC kezelés megfigyelt terápiás hatásainak alapjául szolgáló mechanizmusokat. In vivo kísérletekhez egerekben a LAD artéria lekötését választották klinikailag releváns és jól megalapozott állatmodellként. A funkcionális, szövettani és molekuláris értékelésekhez az állatok számát csoportonként három-tizenöt egérre csökkentették, amint azt az ábra legendái meghatározzák. Az egereket véletlenszerűen osztották be a kezelési csoportokba, és minden elemzést vak módon végeztek.

rHC mátrixok előállítása és jellemzése

1%-os kollagénoldatot állítottunk elő 0,1 g liofilizált kollagén (Rhci és rHCIII, Fibrogénből) 10 ml ultratiszta ddH2O-ban történő feloldásával. kondroitin-szulfátot (CS; Wako), N-etil-N-(3-dimetilaminopropil) karbodiimidet (EDC) és N-hidroxiszukcinimidet (NHS) adtunk hozzá 1:4:0,5:0,3 tömegarányú végső keverék előállítása kollagén:cs:NHS:EDC esetében. Az anyagokat jégen állítottuk elő egy zárt rendszer segítségével, amely homogén keverést tesz lehetővé buborékok hozzáadása nélkül. Alapos keverés után a pH-t 7-re állítottuk.4 által NaOH (1.0 N). A CS nélküli mátrixokat hasonlóan állítottuk elő, de a CS térfogatának kompenzálására PBS-t adtunk hozzá. Az Alexa-Fluor 594-NHS-vel jelölt mátrixokat úgy állítottuk elő, hogy a gélekhez a NaOH (hidrogélenként 25 nmol festék) hozzáadása előtt 20 keverési lépést adtunk hozzá.

anyag viszkozitása

viszkozitás méréseket végeztünk egy Brookfield R/S Plusz reométer (Brookfield) alkalmazásával 37 C. a C25–2/30 kúpos orsót használtunk az anyag összenyomásához (50 km elmozdulás) egy szabályozott hőmérsékletű talapzatra. A viszkozitást rámpás forgóblokkkal mértük 1 / perc sebességgel egységek előre beállítva öt egység nyírási sebességgel 30 perc alatt.

térhálósítás mértéke

differenciális pásztázó kalorimetriás (DSC) kísérleteket végeztünk a térhálósítás mértékének felmérésére. Röviden, a méréseket egy Q2000 differenciál pásztázó kaloriméterben (TA műszerek) végeztük 8-80 C tartományban, 5 kb c perc−1 letapogatási sebességgel. A kollagén mátrixokat (5-20 mg) szűrőpapírral felületszárítottuk, majd alumínium fedéllel (Tzero) hermetikusan lezártuk; Ta hangszerek) alumínium mintatartóban (Tzero; TA hangszerek). A denaturációs hőmérsékletet (TD) az endoterm csúcs kezdetén mértük.

víztartalom

az anyagok víztartalmát a minta nedves tömegének (W0) megmérésével mértük, amelyet PBS-ben egyensúlyba hoztunk 96 órán át 4 oc-n.az anyagot ezután szobahőmérsékleten 96 órán át vákuumban szárítottuk, hogy megkapjuk a száraz tömeget (W). A hidrogélek teljes víztartalmát (Wt) ezután az egyenlet szerint számítottuk ki:

lebomlás

az enzimes lebomlást 50-100 mg hidrogél alkalmazásával mértük, amelyet 5 ml I. típusú kollagenázba (10 U/ml PBS-ben) helyeztünk el 37 CAC-on. a fennmaradó szilárd tömeget legfeljebb 24 órán keresztül mértük.a lebomlási sebességet a fennmaradó tömeg/idő parcellák kezdeti meredekségéből számítottuk ki, és mg / perc-ben jelentettük.

anyag porozitás

alacsony hőmérsékletű pásztázó elektronmikroszkópos (Krio-SEM) méréseket végeztek -50 C-on egy tescan (modell: Vega II – XMU) segítségével, amely hidegfokozatú mintatartóval, BSE-detektorral és szekunder elektrondetektorral (SE) volt felszerelve. A pórusméreteket legalább 250 egyéntől mértük a minta 4-6 véletlenszerű területétől az ImageJ ++ szoftver segítségével. A pórusok átmérőjét a pórusok hossztengelyével számszerűsítettük az egyenes vonalú szerszám segítségével. A kép területét a Tescan Vega II system65 által kapott méretskála sávhoz igazítottuk.

állatkísérletek

minden eljárást az Ottawai Egyetem állatgondozási Bizottsága hagyott jóvá, és az Országos Egészségügyi Intézet útmutatója szerint hajtották végre a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására.

mi modell

MI-t indukáltak 9 hetes nőstény c57bl/6 egerekben (Charles River; az egerek/csoportok száma az ábrán látható), és a kezelést egy bevett protokoll26, 27. Az egereket érzéstelenítettük (2% izoflurán), intubáltuk, és a szívet a negyedik intercostalis thoracotomiával tettük ki. A bal elülső leszálló koszorúér (LAD) ezután közvetlenül a bal pitvarból való megjelenése alatt ligálták. Ez az eljárás nagy MI-t eredményez, amely magában foglalja a szív anterolaterális, posterior és apikális részeit, amelyet a műtét idején az artéria által biztosított régióban a szívizom blansírozásával igazoltak. A rövid hatású buprenorfint a műtét előtt legalább egy órával, a hosszú hatású buprenorfint pedig közvetlenül a műtét előtt subcutan adták be perioperatív fájdalomcsillapítás céljából. Az MI (kiindulási állapot) utáni 1 héten az egereket véletlenszerűen osztották be a PBS (kontroll), rHCI vagy rHCIII mátrixok kezelésére, öt ekvivolumetrikus intramyocardialis injekcióban (10 db / hely, összesen 50 db) 27 G-os tűvel ultrahangvezérelt zárt mellkasi eljárással. A fecskendőt egy mikromanipulátor (VisualSonics) rögzíti, és az injekciós eljárás előtt mind a tű, mind az RMV scanhead szonda a szív hosszú tengelye mentén igazodik. Az ultrahang látómezőn keresztül a mikromanipulátort arra használják, hogy a tű hegyét a kívánt helyre helyezze a szívizomban az injekciók beadásához (lásd a kiegészítő ábrát. 1. Kiegészítő videó 1.). Az egereket terminális érzéstelenítéssel ölték meg a kezelés után 2 nappal vagy 4 héttel, és szíveket gyűjtöttek szövettani és/vagy mechanikai tulajdonságok mérésére.

echokardiográfia

transthoracalis echokardiográfiát végeztünk hosszú tengelyű nézeteken Vevo770 rendszer alkalmazásával B módban, 707b sorozatú valós idejű mikrovizualizációs szkennerfej-szondával (VisualSonics). A képalkotást a kezelés megkezdése előtt (7 nappal az MI után) és az injekció beadása után 28 nappal végezték el a bal kamrai ejekciós frakció (LVEF), a frakcionált területváltozás (FAC), a szisztolés végtérfogat (ESV), a diasztolés végtérfogat (EDV), a stroke térfogata és a szívteljesítmény meghatározása céljából. Megjegyezzük, hogy az LVEF, az ESV és az EDV a HF és a túlélés klinikai előrejelzői az MI44 után.

Ex vivo képalkotás Alexa-Fluor 594-jelölt mátrix

a kémiailag megjelölt rHC mátrixokat (25 nmol festék / hidrogél) injektáltuk az infarktusos egér szívébe, a fent leírtak szerint. Az állatokat a kezelés után 2 órával, 2 nappal és 7 nappal leölték, a szíveket pedig az Ivis (PerkinElmer) segítségével ex vivo leképezték, hogy megjelenítsék az rHCI és az rHCIII eloszlását a szívekben (670 nm, 640 nm). A szövettani vizsgálathoz a szövetrészeket acetonban készítettük el, majd dapi-val festettük, majd egy Leica Aperio Versa slide scanner segítségével képalkotást végeztünk, melynek végső nagyítása 60 fő volt, és egy Z-stack nyolc lépésből állt 1,5 főnél.

Törzselemzés

transthoracikus echokardiográfiát végeztünk hosszú tengelyű nézeteken Vevo3100 rendszer alkalmazásával B módban MX400 sorozatú valós idejű mikrovizualizációs szkennerfej-szondával (VisualSonics). A képalkotást a kezelés megkezdése előtt (7 nappal az MI után) és 2 nappal az injekció beadása után végeztük, hogy meghatározzuk a longitudinális endokardiális törzset az aortabillentyű bezárásakor (ami a végszisztolát képviseli). Az 5. szegmens törzsét (az elülső középső szegmenst), amely megfelel a határzónának a kezelésre szánt területnek injekció, a Vevo LAB 3.1.1 szoftver Vevostrain alkalmazásával elemeztük (VisualSonics) 41. Az elvégzett mérések reprezentatív példáit a kiegészítő ábra tartalmazza. 10 az összes kísérleti csoportra, plusz egy egészséges (nem infarktusos) állatra.

elektrokardiográfia

az elektrokardiogramokat az echokardiográfiával egyidejűleg Vevo3100 rendszerrel (VisualSonics) végezték a kezelés megkezdésekor a kezelés megkezdése előtt (7 nappal az MI után) és 2 nappal az injekció beadása után. Az elektrokardiogramokat a Vevo LAB 3.1.1-ből exportálták. szoftver (VisualSonics). A PR, QT és QRS intervallumok hosszát az ImageJ szoftver segítségével határoztuk meg (1.Kiegészítő táblázat).

a szívizom mechanikai tulajdonságai

az egereket terminális érzéstelenítéssel eutanizálták a kezelés után 2 vagy 28 nappal, és a szíveket betakarították. A bal kamra négyszögletes darabjait (2,5 db 5 mm), amely a heget és a határzónát tartalmazza, kivágtuk. A szövet szakítószilárdságának (Young-modulus) meghatározásához a mintákat mechanikai vizsgálatnak vetettük alá egy IX/S sorozatú szoftverrel felszerelt Instron mechanikus univerzális tesztelővel (3342 modell, Instron), 10 mm min−1 keresztfej sebességgel.

szövettan/immunhisztokémia

a szívek olyan részhalmazából készítettünk Szívlemezeket, amelyeket nem használtak mechanikai tulajdonságok mérésére. Az injekció beadása után 28 nappal a szíveket betakarították, PBS-sel perfundálták, tot-ba ágyazták,és folyékony nitrogénbe fagyasztották. A 10 főből álló szakaszokat kriosztáttal vágtuk le. A heg méretének felmérése érdekében a szövetrészeket 4% PFA-ban rögzítették 1 órán át, és Masson trichrome-eljárással (Sigma) festették. Az Olympus BX50 mikroszkóppal készített képeket 2 db-os objektívvel és egérenként nyolc metszettel végeztük a távoli falvastagság mérésére és a heg méretének meghatározására a miquant software66 középvonali íves módszerrel. Az immunhisztokémia érdekében a szövetrészeket 20 percig acetonban rögzítettük, 0,1% Tritonnal permeabilizáltuk 10 percig, majd 10% szérumban 1 órán át szobahőmérsékleten blokkoltuk. Az elsődleges antitesteket egy éjszakán át, 4 6CC-n, 10% – os szérumban alkalmaztuk, majd a diákat 1 órán át szobahőmérsékleten öblítettük és másodlagos antitestekkel kezeltük, mielőtt fluoreszcens szerelőközeggel (Dako) szereltük volna fel. Az erek és a myofibroblasztok kimutatására szolgáló PECAM-1 (más néven CD31; Santa Cruz 101454, 1:50) és az SMA (Abcam 5694, 1:200) az af594 Anti-rat (Life Technologies a11008, 1:500) és az AF488 anti-rabbit (Life Technologies a11007, 1:500) antitesteket alkalmazták és detektálták. Az M2 makrofágokat AF488-konjugált anti-CD206 antitest (Biolegend 141710, 1:50) detektálta. A kardiális troponin I festéshez a szekciókat AF488-mal jelölt búzacsíra agglutininnel (ThermoFisher, W11261) inkubáltuk 1 órán át 37 C-on, majd kecske kardiális troponin I primer antitesttel (Abcam ab56357, 1:200) inkubáltuk, és szamárkecske elleni af594 szekunder antitesttel (Life Technologies A-11058, 1:500) detektáltuk. Végül a connexin 43 festéshez a szekciókat connexin 43/GJA1 (Abcam ab11370, 1:400) és szív troponin I (Abcam ab188877, 1:200) primer antitestekkel inkubáltuk, majd af488 anti-nyúl (Life Technologies A11007, 1:500) és szamár anti-kecske af594 másodlagos antitesttel (Life Technologies a-11058, 1:500) detektáltuk. Fluoreszkáló képeket egy Zeiss Axio Observer mikroszkóppal kaptunk, melyen egy 20-as számú objektív volt látható, a connexin 43-as festett metszetekhez pedig egy 20-as számú objektívvel rendelkező Leica Aperio Versa diaszk-szkennert használtunk. Az összes IHC-folt esetében egérenként négy szakaszt elemeztek, és minden egyes szakaszhoz 2-4 képet használtak a határzónán belül, az infarktus és a távoli régiók elemzéséhez. H&e festés esetén a szövetrészeket 10% – os formalinban rögzítették. A szakaszokat ezután először hematoxilin gill 2. számú oldatában festettük 7 percig, majd savas alkohol differenciálódás következett, majd 0,5% eozin 7 percig, majd dehidráció következett (az összes oldat a Sigma-ból). A képeket Olympus BX50 mikroszkóppal készítették. A határzónát az infarktus mindkét oldalával közvetlenül szomszédos FOV-ként jelölték ki régió, amely akkor kezdődik, amikor az LV 50% – a fibrotikus hegszövet (lásd kiegészítő ábra. 11 egy sematikus ábrázoláshoz).

cx3cr1-EGFP egérkísérletek

a keringő mononukleáris sejtek myocardiumba történő toborzásának értékelésére rHC kezelést követően B6.129p-Cx3cr1 tm1Litt/J egereket (Cx3cr1-EGFP) vásároltak a Jackson laboratóriumból. Ezek az egerek fokozott zöld fluoreszcens fehérjét expresszálnak monocitákban, dendritikus sejtekben, NK sejtekben és agyi mikrogliákban, és a mononukleáris sejtek szívbe történő felvételének vizsgálatához jelentett modellek67. Az MI után 1 héttel az egerek 50-et kaptak kezelésüknél 6L of PBS, rHCI vagy rHCIII, a fent leírtak szerint. Az állatokat a kezelés után 2 nappal leölték, és vért gyűjtöttek az EDTA csövekbe. Emellett a szíveket PBS-sel perfundálták, és a jobb kamrát és a bal kamra apikális régióját összegyűjtötték. A szöveteket HBSS-sel öblítettük és 2-ben emésztettük.4U / ml dispase I-t (Roche) és 1 mg/ml kollagenáz B-t (Roche) 40 percen át 37 C. a mintákat háromszor PBS-sel mossuk, 5 percig 400 g-on centrifugáljuk, majd az izolált sejteket áramlási citometriára készítjük elő (FACS Aria III; Becton Dickinson). A sejteket APC anti-egér/humán CD11b (Biolegend 101211), PE anti-egér Ly-6G/6C (Biolegend 108407), PE/Cy5 anti-egér F4/80 (Biolegend 123111), PE/Cy7 anti-egér CD38 (Biolegend 102717) és Alexa Fluor 600 anti-egér CD206 (Biolegend 141733), a gyártó által ajánlott hígításokat követve (0.25 6G / L/1 106 cella a CD11b, Ly-6g/6C, CD38 és CD206, valamint 1 6G/L / 106 cella az F4 / 80 esetében). Lásd Kiegészítő Ábra. 12 a válogatás / kapuzás stratégia.

Sejtizoláció és áramlási citometria a monocyta alcsoportokban

két nappal a kezelés után az egereket CO2 inhalációval ölték meg, majd a nyaki diszlokáció következett be. A vért egerekből szívpunkcióval 50 mM-es EDTA-oldatban gyűjtöttük, és a vörösvértesteket vörösvérsejt (RBC) lízis pufferrel lizáltuk a gyártó protokollja szerint (Biolegend 420301). A sejteket a begyűjtött egér szívéből izoláltuk egy emésztő puffer segítségével, amely a következőket tartalmazta: DNáz I (50 E/ML; Sigma D5025), II típusú kollagenáz (400 E/mL; ThermoFisher 17101015), kollagenáz D (0,15 E/mL; Sigma 11088866001) és hialuronidáz (10 E/mL; Sigma H3506). Egy órás emésztést követően 37 C-nél, izolált szívsejteket vezetünk át egy 70 MHz-es szűrőn. Végül a betakarított egér lépeit 70 MHz-es szűrőn keresztül dörzsölték és eldörzsölték, majd vörösvérsejt (RBC) lízis pufferrel inkubálták. A sejtpelleteket centrifugálással gyűjtöttük össze 400g-os 6 percen át 4c. Az összes szövetből izolált sejteket inkubáltuk Zombie Aqua fixable életképességi festékkel (1: 500, Biolegend 423101) 20 percig szobahőmérsékleten. Ezután az Fc receptorokat trustain X reagenssel (1:100, Biolegend 103319) blokkoltuk 10 percig szobahőmérsékleten. A sejteket ezután antitest koktéllal inkubáltuk 45 percig szobahőmérsékleten, amely CD45-APC/Fire 750 (1:160, Biolegend 30-F11), CD11b-PE/Cy7 (1:80, Biolegend M1/70), Ly6G-PerCP/Cy5.5 (1:160, Biolegend 1A8), CD3-PE (1:160, Biolegend 17a2), B220-af488 (1:50, biolegenda RA3-6B2), F480-Af647 (1:100, BIOLEGEND BM8) és Ly6C-BV421 (1:80, BD Biosciences AL-21). Az áramlási citometriát BD FACS Aria III alkalmazásával végeztük, az adatokat FlowJo V10.5.2 szoftverrel elemeztük (lásd a kiegészítő ábrát. 12 a válogatás / kapuzás stratégia). Az egyes szövetek teljes életképes sejtszámát az izolálás után trypan blue kizárással határoztuk meg hemocitométer segítségével. Az egyes leukocita populációkon belüli sejtek teljes számát az adott sejtpopuláció élő sejtjeinek százalékos arányával határoztuk meg, és az izolálás után megszámolt élő sejtek teljes számát, amelyet ezután a szövet mg-jára vagy a gyűjtött vér mL-jére normalizáltunk. Kapuzási stratégia: az egyes sejteket az FSC-A és az FSC-H alapján kapuztuk. Ebből az élő egysejtű populációból a leukociták CD45+voltak. A leukocita részhalmazokat a következőképpen jellemeztük: neutrofilek CD45+CD11b+Ly6G+, Ly6C alacsony monociták CD45+CD11b+Ly6G−F480−Ly6C−, Ly6C magas monociták CD45+CD11b+Ly6G−F480−Ly6C+, makrofágok CD45+CD11b+Ly6G−F480+, T−sejtek CD45+CD11b−Ly6G− CD3+B220−és B−sejtek CD45+cd11b−ly6g-CD3-B220+. Megjegyzés a vér F480 kifejezést nem használták a kapuzási stratégiában. A kapukat az izotípus-vezérlőkhöz viszonyítva állították be.

újszülött kardiomiocita vizsgálatok

újszülött patkány kamrai myocytákat (Nrvm-eket) frissen izoláltunk egy megállapított protokoll68. A 2 napos Sprague-Dawley patkányokból (Harlan) gyűjtött bal kamrákat a tripszin (Amersham Biosciences) és a II.típusú kollagenáz (Worthington biokémiai) emésztette. Az izolált sejteket újra szuszpendáltuk az M-199 táptalajban (Life Technologies), kiegészítve 10% FBS-sel, 19,4 mM-es glükózzal, 2 mM L-glutaminnal, 2 egység/mL penicillinnel, 0,8 egység/mL B12-vitaminnal, 10 mM HEPES-sel és 1 darab nem esszenciális aminosavval (Sigma-Aldrich). Két 60 perces előbevonatot végeztünk, amelynek során a szív fibroblasztok kapcsolódnak az edény aljához, ezáltal gazdagítva a nem ragaszkodó populációt az Nrvm-ek számára. A nem ragaszkodó sejteket (Nrvm-eket) ezután 24 lyukú lemezeken (40 000 sejt/cm2) vetettük be a különböző kollagén mátrixokra. A túlélési vizsgálathoz a 3 napos tenyésztett Nrvm-eket M-199 táptalajnak vetettük alá, amely 50 km hidrogén-peroxidot tartalmazott 3 órán keresztül, majd terminális deoxinukleotidil-transzferáz dUTP Nick-End címkézés (TUNEL) vizsgálatot végeztünk, és az elhalt sejteket három véletlenszerű nézetmezőben számoltuk.

sejttenyészetek

bevett protokoll alkalmazásával csontvelőből származó makrofágokat izoláltunk 8-12 hetes C57BL/6J mice69-ből. Az egereket CO2 belélegzéssel és nyaki diszlokációval eutanizálták, és a sípcsont csontjait összegyűjtötték és médiumokkal öblítették a csontvelő izolálására. A csontvelő izolátumot ismételten pipettáztuk, hogy egysejtű szuszpenziót kapjunk, amelyet ezután egy sejtszűrőn vezetünk át. A frissen izolált sejteket 1 héten át tenyésztettük DMEM-Ben 10% FBS–szel, 20% L929-kondicionált közeggel és penicillin-sztreptomicinnel kiegészítve, majd 3 napig újra bevonjuk az rHC hidrogéleken. A sejteket az rHC hidrogélekből 3 mM-es CaCl2 Hank puffer sóoldatával gyűjtöttük össze, amely 250 egység kollagenáz I-t (Gibco) tartalmaz. A makrofág polarizációt áramlási citometriával (FACS Aria III; Becton Dickinson) értékelték CD86 és CD206 (Biolegend) alkalmazásával az M1 és M2 makrofágok azonosítására. A mononukleáris sejtek izolálásához a sípcsontok csontvelőjét a fent leírtak szerint gyűjtöttük össze. A mononukleáris sejteket sűrűséggradiens centrifugálással tisztítottuk Histopaque (Sigma) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. A sejteket 0-val jelöltük.5 6-12 hetes egerek sípcsontjainak és combcsontjainak öblítésével izoláltuk a mononukleáris sejteket (Sigma) 30 percig 37 C. 6870>

makrofág adhéziós vizsgálattal

a mononukleáris sejteket 3-12 hetes egerek sípcsontjainak és combcsontjainak öblítésével. A sejteket sűrűséggradiens centrifugálással tisztítottuk Histopaque (Sigma) alkalmazásával a gyártók utasításai szerint. A mononukleáris sejteket megszámoltuk és dapi-val jelöltük. A sejteket a különböző biológiai anyagokon 50 000 sejt/cm2 koncentrációban 24 órán át bevontuk. a sejteket 4% PFA-val rögzítettük 5 percig, és a sejteket megszámoltuk. Az adatokat a kontrollhoz viszonyítva fejeztük ki (nem bevont kutak, azaz., TCP-k) a donorok közötti sejtváltozékonyság hatásának minimalizálása érdekében.

makrofág migrációs vizsgálat

csontvelő mononukleáris sejteket tenyésztettünk DMEM-Ben 10% FBS-szel, 20% L929 kondicionált táptalajjal és Pen/Strep-vel kiegészítve 7 napon keresztül csontvelőből származó makrofágok (BMDMs) előállításához, és dapi-val jelöltük, a fent leírtak szerint. A bmdm-eket (2 ~ 105) ezután újra szuszpendálták a növekedési faktorok és szérum nélküli EBM-ben, és betöltötték egy Transwell lemez (Life Technologies) felső kamrájába, amelyet 100 ~ ~ rhci-vel vagy rHCIII-vel vontak be. Az alsó kamra teljes makrofág táptalajt tartalmazott a fent leírtak szerint. 24 óra elteltével a betéteket eltávolítottuk, és a biológiai anyagon átvándorolt Bmdm-ek számát vakon számszerűsítettük egy Zeiss Z1 fluoreszcens mikroszkóp segítségével. Az adatokat a kontrollhoz viszonyítva fejeztük ki (nem bevont kutak, azaz TCP-k) a donor sejtek közötti variabilitás hatásának minimalizálása érdekében.

makrofág polarizációs vizsgálat

Bmdm-eket DMEM-Ben, 10% FBS-sel, 20% L929 kondicionált táptalajjal és Pen/Strep-vel kiegészítve 7 napon át, a fent leírtak szerint. A makrofág aktivációs kísérletekhez a sejteket 3 napig stimuláltuk lipopoliszachariddal (1 ~ g/ml; Sigma) plusz IFN-6 (50 ng / ml; Sigma) M1 aktiváláshoz, vagy IL-4 (20 ng/ml; R&D rendszerek) M2 aktiváláshoz. A teljes RNS-t Tri reagenssel (Zymo Research) extraháltuk, a gyártó protokolljának megfelelően. Az első szálú cDNS-t Smartscribe reverz Transzkriptázzal (Takara Bio USA) és random hexamer primerekkel (Fisher Scientific) szintetizálták. A célgén mRNS-szintjét kvantitatív RT-PCR-rel mértük LightCycler 480 SYBR Green I Mastermix (Roche) és egy LightCycler 480 valós idejű PCR rendszerrel (Roche). A primer Párok szekvenciáit a 2. Kiegészítő táblázat sorolja fel. Relatív változások az mRNS expresszió határoztuk meg a kb ct módszer, kifejezve szintek képest 18S.az adatokat a kontrollhoz viszonyítva fejeztük ki (nem bevont kutak, azaz TCP-k) a donorok közötti variabilitás hatásának minimalizálása érdekében.

túlélés H2O2 expozíció után

sejteket tenyésztettünk 7 napig DMEM-Ben, 10% FBS-sel, 20% L929 kondicionált táptalajjal és Pen/Strep-vel kiegészítve. A 7.napon a táptalajt 0,5 mM-es hidrogén-peroxidot tartalmazó DMEM-re változtatták, és a sejteket 3 órán át tenyésztették, mielőtt 7-AAD-val festették volna áramlási citometriával történő elemzés céljából. Az adatokat a kontrollhoz viszonyítva fejeztük ki (nem bevont kutak, azaz TCP-k) a donor sejtek közötti variabilitás hatásának minimalizálása érdekében.

Statisztikai analízis

a statisztikai analízist a 4.5-ös kaleida-grafikon alapján végeztük. Minden adatot átlagként mutatunk be. A kezelések közötti in vivo adatok összehasonlításához ANOVA-t használtunk, amelyet Holm korrekciója követett többszörös összehasonlításhoz. A heg méretét többszörös regresszióval elemezték, beleértve a kezelési csoportot (rHCI, rHCIII és PBS) és a kiindulási LVEF-et. a PBS-szel összehasonlítva az rHCI és az rHCIII szignifikáns előrejelzői voltak az infarktus méretének a kiindulási LVEF mellett. A modell korrelációs együtthatója 0,6 stata többszörös lineáris regresszió alkalmazásával. Az In vitro NRVM, makrofág és szív fibroblaszt adatokat egy tanuló t-tesztjével vagy egy egyirányú ANOVA-val elemezték, Holm-korrekcióval többszörös összehasonlításhoz, az ábrán meghatározott legendák szerint.

jelentés összefoglaló

a kutatási tervezéssel kapcsolatos további információk a cikkhez kapcsolódó Nature Research Reporting Summary-ban találhatók.