kloramfenikol-acetil-transzferáz, mint a chlamydialis transzformáció szelekciós markere
PGFP::SW2, a Wang et al. Egy macska gént is hordoz, amely összeolvad a GFP génnel . Megállapítottuk, hogy a pGFP:: SW2 plazmiddal transzformált E. coli képes volt kloramfenikolt tartalmazó közegben (végső koncentráció: 170 ~ g/ml), ami arra utal, hogy a CAT gén szelekciós markerként is használható a chlamydialis transzformációs kísérletekben. Amint arra Wang et al., a kloramfenikol káros hatása a gazdaszervezet mitokondriumaira, amint azt Li et al. befolyásolhatja ennek az antibiotikumnak a hasznosságát a chlamydialis transzformációban . In Li et al.a jelentés szerint a kloramfenikol minimális toxikus koncentrációja 10 ~ g/ml volt, ami az ATP termelés enyhe 20% – os csökkenését okozta. Megállapítottuk, hogy a látszólagos legalacsonyabb kloramfenikol koncentráció, amely teljesen gátolta az inklúzió kialakulását a plazmidmentes C-ben. trachomatis L2 törzs kijelölt L2R csak 0,05 (az adatok nem jelennek meg), amely messze elmarad a koncentrációk toxikus a gazdasejtekre. Ezért úgy érveltünk, hogy ez az antibiotikum felhasználható a CAT-expresszáló transzformánsok kiválasztására anélkül, hogy jelentősen megterhelné a gazdasejteket.
az L2R-t pgfp::SW2-vel transzformáltuk, a transzformált sejtek egyik felét ampicillinnel, a másik felét kloramfenikollal választottuk ki. Az antibiotikumokat (2 ~ g/ml ampicillin vagy 0,1 ~ g/ml kloramfenikol) a transzformáció után 10 órával adtuk a tenyészetekhez. A 2. szakasztól kezdve koncentrációikat 5-re, illetve 0,2-re növeltük 6G/ml, és az inokulációkor adtuk hozzá őket. Az átjárók közötti hasítási arány 1: 1 maradt az 1. átjárótól a 4. átjárón át. Annak ellenére, hogy a kloramfenikol MIC-je, amelyet a fertőzés alacsony multiplicitása mellett határoztak meg (~0,1 inklúziót képző egység sejtenként), 0,05 volt 6G/ml, a nem átalakult chlamydiák egy része várhatóan 0,1 – 0 jelenlétében zárványokat képez.2G/ml az antibiotikum, mivel a transzformációhoz magas EB / sejt arányt használtunk, és az antibiotikumok által okozott chlamydialis növekedés gátlásának hatékonyságát befolyásolja a fertőzés sokasága . A fent leírt szelekciós protokollal, ampicillinnel kiválasztott tenyészetekben, fáziskontraszt mikroszkóp alatt, közel 100% – ban a sejteket aberráns RBs-sel való befogadásnak találták a kezdeti áthaladásnál. Az aberráns RB-tartalmú zárványok még mindig jelen voltak a sejtek kis hányadában a 2. átjárónál, de többnyire látszólag normális zárványokkal helyettesítették őket a 3.átjárónál. A sejtek körülbelül 20% – ában normális zárványokat találtak, a 4.átjárónál pedig ritkán figyeltek meg rendellenes zárványokat. Az 5. átjárónál, amely a 4.átjáróból származó 10% – os betakarítással történő beoltás eredményeként jött létre, zárványokat találtak 80% – os sejtekben; nyilvánvalóan ezen zárványok egyike sem tartalmazott aberráns RBs-t.
mivel a kloramfenikol nem okozza a chlamydiae rendellenes RBs kialakulását, az antibiotikummal szembeni rezisztenciát az inklúzió mérete alapján ítéltük meg. A normálnál kisebb méretű zárványokat szinte az összes sejtben detektáltuk a folyosón 1. Néhány, de nagyon kis méretű zárványt találtak a 2. átjárónál, és a legtöbb ilyen zárványt normál méretű zárványokkal helyettesítették a 3.átjáróval. Normál méretű zárványokat találtak a sejtek több mint 20% – ában a 4.átjárónál. Az 5. szakaszban, amelyet a 10%-os 4.átjárási betakarítással történő beoltás után nyertünk, és a kloramfenikol-koncentráció növekedése (0,2 ~ g/ml-ről 0,5 ~ g/ml-re), normál méretű zárványokat találtunk közel 100% – os sejtekben 00000000.
a szelekciós ágensekkel szembeni látszólagos rezisztencia mellett a GFP expressziót és a glikogénszintézis helyreállítását használtuk további markerként a sikeres transzformációhoz . Az 5. átjáróból begyűjtött Eb-ket a McCoy-sejtek 1:100 hígítási sebességgel történő megfertőzésére (sejtszám-egyenértékűség) használták a GFP expressziót és a glikogénszintézist meghatározó kísérletekhez (2.ábra). Ahogy az várható volt, sem a vad típusú plazmid-teli C. trachomatis L2 (434/bu) (2a.ábra), sem a nem transzformált plazmidmentes L2R (2b. ábra) nem fejezte ki a GFP-t. Összhangban van azzal a megállapítással, hogy a glikogén szintézis a C-ben. a trachomatis megköveteli plazmidját , a jódfolt azt mutatta, hogy a glikogén felhalmozódott a vad típusú L2 (2a.ábra) zárványaiban, de nem az L2R (2b. ábra) zárványaiban. Az RB-osztódást gátló 5 6G/ml ampicillin jelenlétében a nem transzformált L2R (2C ábra) óriási RBs-t tartalmazó zárványokat képez glikogén előállítása nélkül; míg a kloramfenikol (végső koncentráció: 0,5 g/ml) teljesen gátolta a látható zárványok kialakulását az L2R fertőzött sejtekben (2D ábra). Összhangban van a Wang et al. , pGFP::SW2-transzformált L2R kiválasztott ampicillin képződött GFP-pozitív zárványok glikogén (ábra 2e). a kloramfenikollal kiválasztott PGFP:: SW2-transzformált L2R glikogént tartalmazó GFP-pozitív zárványokat is képezett (2F ábra). Ahogy az várható volt, az ampicillin által kiválasztott transzformánsok képesek voltak normál méretű, GFP-pozitív, glikogéntartalmú zárványokat képezni kloramfenikol jelenlétében (2G ábra); hasonlóképpen, a kloramfenikol által kiválasztott transzformánsok teljesen rezisztensek voltak az ampicillinnel szemben, GFP-t expresszáltak és glikogént termeltek (2h ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a macska gén a pGFP – ben::Az SW2 plazmid funkcionális a chlamydiae – ban, a kloramfenikol-rezisztencia pedig szelekciós markerként használható a chlamydialis transzformációhoz.
a C PGFP::SW2 transzformánsainak befogadása, GFP expressziója és glikogénszintézise . trachomatis L2. A nem transzformált 434/bu (A), nem transzformált plazmidmentes L2R (B-D) törzset, valamint az ampicillinnel (E, G) vagy kloramfenikollal (F, H) kiválasztott transzformált L2R törzset vagy jelzett antibiotikumot tartalmazó táptalajjal, vagy antibiotikummentes táptalajjal tenyésztettük. A festetlen és jódfestett tenyészetekben lévő zárványok képeit fáziskontraszt mikroszkóppal vagy fluoreszcens mikroszkóppal szereztük be 48 órával az oltás után. Minden panelen a fáziskontraszt és a GFP képek egymásra helyezhetők.
ezután eltávolítottuk a pgfp-ből a ons-laktamáz gént::SW2 plazmid a “módszerek” szakaszban leírtak szerint, és a kapott pGFP-CAT::SW2 plazmidot használták az L2R átalakításához. a transzformált chlamydiákat kloramfenikollal szelekciónak vetettük alá a fent leírt módon. A kloramfenikol-rezisztens zárványok a fertőzött sejtek körülbelül 20% – ában jelentek meg a 4.áthaladás kultúrájában. A fluoreszcens mikroszkópia és a jódfolt GFP-és glikogén-pozitív zárványokat mutatott ki az 5. áthaladásból nyert EBs-vel fertőzött sejtekben, és kloramfenikol jelenlétében tenyésztették (3. ábra, felső panel). A pgfp-CAT::SW2 plazmidban azonban a pgfp-laktamáz hiánya miatt a transzformánsok nem voltak képesek normális zárványokat kialakítani ampicillin jelenlétében; ehelyett zárványaikat aberráns RBs-sel töltötték meg. Míg a szabálytalan zárványok még mindig pozitívak voltak a GFP szempontjából, nagyrészt glikogénmentesek voltak (3.ábra, alsó panel). Az 5. szakasz után a pGFP-CAT:: SW2 transzformánsokat tenyésztettük 0,5 6G/ml kloramfenikollal további négy szakaszra 1: 100 hasítási arány mellett minden egyes szakaszra. A 9. szakasz összes zárványa ugyanolyan megjelenésű volt, mint a plazmidokkal teli chlamydiák zárványai, nem pedig a plazmidmentes L2R zárványai, és mindegyikről megállapították, hogy GFP-t expresszál (az adatok nem szerepelnek). Ezek az eredmények bizonyítják, hogy a PGFP-CAT::SW2 plazmidban lévő CAT gén, hasonlóan a pGFP::SW2 plazmidhoz, a C. trachomatis transzformáció szelekciós markereként működik.
inklúzió, GFP expresszió és glikogén szintézis az L2R-ben pgfp-CAT::SW2-vel transzformálva. A kloramfenikollal kiválasztott transzformánsokkal fertőzött sejteket vagy kloramfenikolnak, vagy ampicillinnek tették ki. A festetlen és jódfestett tenyészetekben lévő zárványok képeit fáziskontraszt mikroszkóppal vagy fluoreszcens mikroszkóppal szereztük be 48 órával az oltás után. A fáziskontraszt és a GFP képek egymásra helyezhetők.
meg kell jegyezni, hogy Tam et al. korábban megpróbált egy transzformációs rendszert kifejleszteni a CAT génnel, mint szelektív markerrel . Ebben a tanulmányban, egy macska gént tartalmazó transzfervektort elektroporáltak EBs C-be. trachomatis E (UW-5/CX törzs) és L2 (434/Bu törzs). Bár mind a macska mRNS, mind az enzimaktivitás kimutatható volt a transzformált chlamydiae kezdeti kultúráiban, a szerzők nem tudtak stabil transzformánsokat szerezni a kloramfenikollal történő szelekció után 4 szakaszra. Fontos megjegyezni, hogy mindkét elektroporált törzs natív plazmidot tartalmaz, amelynek replikációs eredete megegyezik a transzformációhoz használt rekombináns plazmiddal . Mivel Wang et al. stabil penicillin-rezisztens transzformánsokat csak az L2R-ből, egy plazmidmentes C-ből tudtak előállítani. trachomatis L2 variáns, de nem a vad típusú, plazmid-replete 434 / Bu, egyébként azonos kísérleti beállítások mellett, utólag nem meglepő, hogy Tam et al. nem sikerült stabil kloramfenikol-rezisztens chlamydiae-t levezetni.
