Kolónia PCR

a kolónia PCR egy kényelmes, nagy áteresztőképességű módszer az insert DNS jelenlétének vagy hiányának meghatározására plazmid konstrukciókban. Az egyes transzformánsok vagy vízben lizálhatók egy rövid melegítési lépéssel, vagy közvetlenül hozzáadhatók a PCR-reakcióhoz, és a kezdeti melegítési lépés során lizálhatók. Ez a kezdeti melegítési lépés a plazmid DNS felszabadulását okozza a sejtből, így sablonként szolgálhat az amplifikációs reakcióhoz. Az insert DNS-t kifejezetten megcélzó primerek felhasználhatók annak meghatározására, hogy a konstrukció tartalmazza-e a kérdéses DNS-fragmentumot. Alternatív megoldásként a betétet szegélyező vektor DNS-t célzó primerek felhasználhatók annak meghatározására, hogy a betét megfelelő molekulaméretű-e vagy sem. Az Insert specifikus primerek információt nyújthatnak mind az insert DNS specifitásáról, mind méretéről, míg a vektorspecifikus primerek használata lehetővé teszi több konstrukció egyidejű szűrését. A kolónia PCR felhasználható a betét tájolásának meghatározására is. A plazmid PCR-amplifikációja egy vektorspecifikus primerrel párosított betétspecifikus primer alkalmazásával csak akkor tervezhető meg egy meghatározott méretű amplikon előállítására, ha a betét a megfelelő tájolásban van. Minden kísérleti tervben a PCR-amplikon jelenlétét vagy hiányát, valamint a termék méretét elektroforézissel határozzák meg egy agarózgélen lévő DNS-méretmarkerrel együtt.

Vélemény, hozzászólás?

Az e-mail-címet nem tesszük közzé.