kollagén szintézis
a Csontkollagén szintézis szabályozása
a kollagén szintézist rágcsáló calvariae és sejttenyészetek szervkultúráiban több különböző vizsgálat segítségével értékelték . A legszélesebb körben alkalmazott vizsgálatban a calvariae-kat és a sejteket radioaktívan jelölt prolinnal inkubáljuk néhány órán keresztül a tenyésztés vége előtt. A radioaktívan jelölt prolin beépülését kollagenáz-emészthető fehérjébe (CDP jelölés) és noncollagen fehérjébe (NCP jelölés) a tenyészetek kivonataiban mérjük, nagy tisztaságú bakteriális kollagenáz alkalmazásával . A százalékos kollagénszintézist a CDP és az NCP értékekből számítják ki, miután korrigálták a kollagénben lévő prolin nagyobb mennyiségét a nem kollagénfehérjékhez képest . A kollagéntermelés a sejt-vagy szervkultúrák hidroxiprolin-tartalmának mérésével is meghatározható, mivel a hidroxiprolin gyakorlatilag egyedülálló a kollagéneknél. Ezek a módszerek nem tesznek különbséget a fibrilláris kollagén különböző típusai között. A csontszervkultúrák és a legtöbb oszteoblasztos sejttenyészet által szintetizált kollagén azonban nagyrészt I. típusú (>95%), így a CDP jelölési értéke általában az I. típusú kollagénszintézist tükrözi. Kívánt esetben a különböző kollagéntípusok előállítása ioncserélő kromatográfiával és sejt-vagy szervkultúrák radioaktívan jelölt kivonatainak poliakrilamid gélelektroforézisével különböztethető meg . Az I. típusú kollagén expresszióját az emberi sejttenyészetekben a procollagen I C-terminális propeptid szekréciójának mérésével is értékelték . Végül specifikus cDNS-próbákat Északi blotban és allél-specifikus primereket reverz transzkriptáz-polimeráz láncreakciós vizsgálatokban használtak a kollagén mRNS expressziójának értékelésére csontmodellekben. Az 1,25(OH)2D3 kollagénszintézisre és mRNS-szintekre gyakorolt hatásának mérése hasonló eredményeket adott a különböző vizsgálatok alkalmazásával.
az 1,25(OH)2D3 gátolja a kollagén szintézist a 21 napos magzati patkány calvariae és újszülött egér calvariae szervkultúráiban, csekély vagy semmilyen hatással a nem kollagén fehérjeszintézisre. A kollagénszintézis maximális gátlása 1,25 (OH)2D3-mal patkány calvariae-ban (körülbelül 50%) 10 nM-nél fordul elő . Az 1,24 R,25 – (OH)3d3 szintén gátolja a kollagén szintézist, de kevésbé hatékony, mint az 1,25(OH)2D3 . A 25 – (OH)D3 és a 24R,25(OH)2D3 nem változtatja meg a kollagén szintézist 100 nM alatt . A D-Vitamin metabolitok gátolják a kollagén szintézist és stimulálják a magzati patkány hosszú csontjainak reszorpcióját hasonló relatív potenciállal, amely korrelál a metabolitok affinitásával a csontváz VDR-jéhez . A kollagén szintézis 1,25(OH)2D3 gátlásának sejtszelektivitásának meghatározásához a magzati patkány calvariae szervkultúráit 1,25(OH)2D3-mal kezeltük 22 órán keresztül, majd tritiated prolinnal inkubáltuk a végső 2 h tenyészethez. A központi csontot (Érett oszteoblasztok) a periosteumtól (kevésbé érett osteoprogenitorok és fibroblasztok) mentesen boncoltuk, és mindkét rekeszt külön-külön elemeztük a tritiatált prolin beépülése szempontjából. Az 1,25(OH)2D3 csökkenti a kollagén szintézist a központi csontban, de nem a periosteumban, jelezve az 1,25 (OH)2D3 hatás szelektivitását Érett oszteoblasztokra . Egy in vivo protokollt alkalmazva, amelyben újszülött patkányoknak tritiated prolin többszöri injekciót adtak az újonnan szintetizált csontmátrix radioizotópos megjelölésére, 25 ng 1,25(OH)2D3 az 1., 3. és 5. napon gátolta a csontmátrix szintézisét, a sípcsont és a calvaria autoradiográfiáinak hisztomorfometriájával értékelve.
1,25(OH)2D3 gátolja a kollagén termelést patkány osteoblast osteosarcoma ROS 17/2.8 sejtekben , primer patkány és egér osteoblast sejtekben és egy halhatatlanná vált egér osteoblast sejtvonalban (MMB-1) . Az 1,25 (OH)2D3 nagyobb gátló hatással van az I. típusú kollagénszintézisre az elsődleges egér oszteoblasztos sejtek log fázisú növekedése során, mint az összefolyásnál, talán azért, mert a proliferáló sejtek több VDR-t tartalmaztak . Hasonlóképpen, a kollagénszintézis 1,25 (OH)2D3 gátlása nagyobb az MMB-1 sejtek ritka tenyészeteiben, amelyek magasabb VDR-szinttel rendelkeznek, mint az összefolyó MMB-1 sejtek . 1,25 (OH)2D3 a kollagén szintézis gátlása egyenértékű a ritka és összefolyó patkány primer osteoblast sejtekben , de a VDR szám nem változott a sejtek növekedése során . Ezek az adatok együttesen azt mutatják, hogy a kollagénszintézis gátlásának mértékét az 1,25(OH)2D3 nagymértékben meghatározza a VDRS sejtmennyisége. Az 1,25(OH)2D3 gátolja a kollagén mRNS szintet a patkány primer oszteoblasztos sejtek hosszú távú tenyészeteinek proliferációs fázisában, és megakadályozza a mineralizált csontcsomók kialakulását ezeken a tenyészeteken . Ezek a vizsgálatok azt mutatják, hogy az 1,25(OH)2D3 gátolja az osteoprogenitorok differenciálódását, amelyek mineralizált csomókat képeznek az elsődleges patkány osteoblast sejttenyészetekben . A csomóképződés 1,25(OH)2D3 általi gátlása azonban másodlagos lehet az I. típusú kollagénszintézis elnyomásához képest a tenyészetekben.
a fent leírt gátló hatásokkal ellentétben az 1,25 (OH)2D3 átmenetileg stimulálja a kollagén és a nem kollagén fehérjeszintézist (kb. kétszerese), amely 12 és 24 óra között tetőzik az immortalizált egér osteoblast sejtvonalban MC3T3-E1 . Ebben a tanulmányban a kultúrák által szintetizált kollagén százalékos arányát (kollagén a teljes fehérjeszintézishez viszonyítva) nem jelentették; ennek eredményeként nem lehetett meghatározni az 1,25(OH)2D3 hatás szelektivitását a kollagénszintézis szempontjából. Az 1,25 (OH)2D3 növeli a kollagén expressziót az MG-63 humán osteoblastos osteosarcoma sejtvonalban és az emberi osteoblastos sejtek elsődleges tenyészeteiben . Érdekes módon a kollagén szintézis 1,25(OH)2D3-mal történő növekedését az mg63 sejtekben blokkolja az inzulinszerű növekedési faktor kötő fehérje 5, amely közvetlenül kölcsönhatásba lép a VDR-rel, és megakadályozza a heterodimerizációt a retinoid X receptorral RXR . Más vizsgálatokban azonban kimutatták, hogy az 1,25 (OH)2D3 csökkenti a százalékos kollagénszintézist az MC3T3-E1 sejtekben . Az MC3T3-E1 és az MG-63 preosteoblasztos sejteket képviselnek, amelyek in vitro oszteogén differenciálódáson mennek keresztül aszkorbinsavval; az 1,25(OH)2D3 gátolja a sejtnövekedést és növeli az oszteokalcin expressziót és az alkalikus foszfatáz aktivitást mindkét sejtvonalban. Az MC3T3E1 sejtek, mint a legtöbb halhatatlanná vált oszteoblasztikus sejtvonal, jelentős fenotípusos variációt mutatnak . Ezért ezen eltérések némelyike a kísérletekhez használt sejtek variációinak tudható be. Ezek az adatok együttesen arra utalnak, hogy az 1,25(OH)2D3 differenciáló hormonként működhet az oszteoblaszt vonal korai sejtjeiben, ami fokozott I. típusú kollagén expressziót eredményez. Ezzel szemben az 1,25 (OH)2D3 gátolja az I. típusú kollagén expressziót Érett oszteoblasztokban.
