kromoszóma festés
8 kromoszóma terület
ahelyett, hogy szétszóródna a magban, minden kromoszóma külön térfogatot foglal el, amelyet kromoszóma területnek neveznek. Ezt kromoszóma-festéssel bizonyították-egy HALALAPÚ technikával, ahol a genomot nagyszámú kromoszóma-specifikus próbával hibridizálják, hogy lehetővé tegyék az egyes kromoszómák megjelenítését a magban. A kromoszóma radiális elhelyezkedését erősen befolyásolja annak összetétele-a génszegény kromoszómák általában a nukleáris perifériához közelebb helyezkednek el, míg a génben gazdag kromoszómák gyakrabban helyezkednek el a belső tér felé . Ezt a tendenciát szemlélteti a 18-as és a 19-es kromoszóma, amelyek nagyon hasonló méretűek, de nagyon eltérő szekvenciaösszetételűek: a 18-as kromoszóma génszegény, míg a 19-es gén gazdag. A Bickmore lab a kromoszóma terület halak segítségével vizsgálta a két kromoszóma helyzetét a magban, és megállapította, hogy a 18 .kromoszóma következetesen közelebb helyezkedik el a nukleáris perifériához, mint a 19. kromoszóma mind a limfoblasztoid, mind a fibroblaszt sejtvonalakban. A kromoszómák radiális pozicionálása a magban szintén szövetspecifikusnak bizonyult, szorosabban rokon sejttípusok hasonló kromoszóma-pozicionálást mutatnak . Az emberi genom öt akrocentrikus kromoszómát is tartalmaz, amelyek rDNS szekvenciákat tartalmaznak—a 13., 14., 15., 21. és 22. kromoszómákat, amelyek általában a nukleolus köré csoportosulnak-a riboszomális RNS transzkripciójának és feldolgozásának helye.
a kromoszóma-pozicionálás radiális szabálya befolyásolja a váltakozó génben gazdag és génszegény szegmensek elhelyezkedését is a kromoszómákon belül—ebben az esetben a génben gazdag szegmensek központilag helyezkednek el, míg a génszegény régiók a perifériához közelebb eső régiókat foglalják el. Ezenkívül a kromoszómaterületeken belül a transzkripciósan inaktív szegmensek belsőleg, a transzkripciósan aktív szegmensek pedig a terület felszínén helyezkednek el . Ez az elrendezés lehetővé teszi a transzkripciósan aktív régiók számára, hogy hozzáférjenek a transzkripciós géphez és az mRNS metabolikus faktorokban gazdag doménekhez, mint például az SC-35 gócokhoz . A kromoszóma-területek finom részletességű szerkezete azonban még nem tisztázott, ami tükrözi az őket formáló kromatin-struktúrák ismeretének hiányát.
genomstabilitás szempontjából a kromoszóma-pozicionálási minták fontos következménye a transzlokációkhoz kapcsolódik, amely a leggyakoribb kromoszóma-rendellenesség az emberi populációban. Jól megalapozott, hogy a két kromoszóma fizikai közelsége a magban befolyásolja a transzlokáció valószínűségét közöttük (ábra. 23.3).
23.3. ábra. A kromoszómák előnyös pozíciói a magban befolyásolják a transzlokáció gyakoriságát.
a sejtmagban ugyanolyan előnyös radiális helyzetű kromoszómák (pl. a 17.és 19. kromoszóma) nagyobb valószínűséggel vesznek részt a transzlokációban, mint a különböző radiális helyzetű kromoszómák (pl. a 17. és 18. kromoszóma).
az emberi populáció különböző nem patogén transzlokációinak gyakorisága és a kromoszómák előnyös radiális pozíciói közötti elemzés azt találta, hogy a hasonló magpozíciójú kromoszómák gyakrabban alakulnak ki transzlokációkban, mint azt véletlenül várták . Egy másik tanulmány képes volt kimutatni a BCR és az ABL lokuszok szoros közelségét, amely részt vesz a jól jellemzett t(9; 22) transzlokációban, amely “Philadelphia” kromoszómát képez krónikus mieloid leukémiában. A szerzők kimutatták, hogy a BCR és az ABL lokuszok közelebb vannak a B-limfocitákban, mint a hematopoietikus progenitor sejtekben, ami arra utal, hogy a sejttípus–specifikus szempontok a nukleáris szerveződésben hozzájárulhatnak bizonyos transzlokációk egyes ráktípusokkal való összefüggéséhez. 2013-ban a Misteli lab közzétett egy tanulmányt, amely a kettős szálú törések és az azt követő transzlokáció kialakulásának dinamikáját vizsgálja egy elegáns rendszerben: a NIH3T3duo sejtek kis számú SceI restrikciós enzimhelyet kódolnak különböző kromoszómákba integrálva, néhány hely a LacO tömb mellett, más helyek pedig a TetO tömb mellett. Az SceI enzim szünetindukciója után nyomon lehetett követni azokat a töréseket, amelyeket fluoreszcensen jelölt Lac (LacR) és Tet (TetR)-represszor fehérjék; a transzlokáció kialakulását a LacR és TetR jelek tartós, stabil együttes lokalizációja jelezte. A szerzők bizonyítani tudták, hogy a legtöbb transzlokációt olyan lokuszok alkotják, amelyek szorosan helyezkednek el a törés indukciója előtt (kontaktus-első modell), nem pedig a kettős szálú törések proximális helyekre történő mozgásának eredményeként (törés-első modell).
a kromoszóma területek elemzésére szolgáló módszereken túl két fő kiegészítő módszert alkalmaznak a genom 3D-s szerveződésének tanulmányozására a magasabb rendű doménszerkezet szintjén: HALALAPÚ módszerek és kromoszóma-megerősítési módszerek . A halak a fluoreszcensen jelölt próbák hibridizációjára támaszkodnak az egyes lókuszok, a genom meghatározott részei vagy az egész kromoszómák megjelenítésére. Pillanatképet ad a nukleáris szerkezetről egycellás szinten, de hátránya, hogy időigényes és korlátozott mennyiségű információt szolgáltat alacsony felbontással. A kromatin konformáció rögzítésének (3C) technikái a nukleáris szerkezet “fagyasztására” támaszkodnak a magon belüli térhálósító kölcsönhatások révén, ligálva a keresztkötések közelében tartott DNS-fragmenseket, majd PCR vagy következő generációs szekvenálás a hibrid DNS-fragmensek azonosítására, amelyek az érintkezésre utalnak. A legkifinomultabb végén ezek a technikák elméletileg azonosíthatják az összes lehetséges kölcsönhatást a genomban, de vannak hátrányai is. A halakkal ellentétben a 3C technikák a sejtek populációin dolgoznak, nem pedig egyetlen sejt szintjén, olyan populációs átlagot produkálva, amely számos különböző érintkezési konfigurációt tükrözhet egyetlen sejt szintjén. A figyelmeztetések ellenére a 3C módszertanok nagyon befolyásosak voltak a 3D genomszervezés területén, hozzájárulva a topológiailag asszociáló domének (Tad) fogalmához. A tad-k olyan régiók, amelyek mérete 900 kb, ahol az érintkezési térképek fokozott interakciókat mutatnak; HALALAPÚ vizsgálatok kimutatták, hogy a TAD-en belül elhelyezkedő szondák fizikailag közelebb vannak, mint a nem ugyanazon TAD-en belül elhelyezkedő, de hasonló “lineáris” genomi távolság választja el egymástól . A teljes emberi genom körülbelül 2000 Tad-ra oszlik, amelyek átfedésben vannak a hisztonjelek eloszlásával és más genomi jellemzőkkel, például a replikáció időzítésével (később ismertetjük). Ezek azonban nem sejttípus-specifikusak, és az a kérdés, hogy a strukturális szervezettség milyen szintjét tükrözik, és funkcionális jelentőségük még mindig vita tárgyát képezi. Érdekes módon, a kromoszóma területekkel megfigyelt transzlokációs frekvencia mintázata a TAD szervezettségi szintjére is visszavezethető-egy B-sejtekben végzett tanulmány megállapította, hogy a két lókusz közötti transzlokáció valószínűsége szorosan összefügg a közöttük lévő érintkezési gyakorisággal, a kromoszóma megerősítés elfogása által generált kontakt térképek .
