Mi az a colony PCR?
a kolónia PCR egy gyors, nagy áteresztőképességű PCR módszer a plazmidba behelyezett DNS jelenlétének vagy hiányának meghatározására közvetlenül a baktériumtelepekről.
a molekuláris klónozás régóta az egyik legnépszerűbb módszer a DNS-transzformációra. A DNS-betét jelenlétének vagy hiányának meghatározásához azonban transzformációs kísérleteket kell végeznünk.
a kolónia PCR egy új módszer, amelyben a beillesztett DNS-specifikus primerek megtervezésével azonosíthatjuk, hogy az érdeklődésre számot tartó DNS-ünk be van-e helyezve a plazmidba vagy sem.
ez azonban nem olyan egyszerű, mint amiről beszélünk.
ebben a cikkben a kolónia PCR-re, különösen a kolónia PCR elvére, annak előnyeire és korlátaira összpontosítunk.
ehhez több kifejezést és témát kell megértenünk. A témát az alapoktól kezdjük. A cikk tartalma,
főbb témák:
“a plazmid a bakteriális kör alakú DNS, amely a bakteriális kromoszómától függetlenül replikálódik, és amelyet a génmanipuláció és a géntranszfer során használnak.”
a genetikai klónozás egy hagyományos molekuláris genetikai eszköz, amelyet régóta használnak a laboratóriumokban. Röviden, a génklónozás során az érdeklődésünkre szolgáló gént mesterséges eszközökkel illesztjük be a plazmidba. Ez a DNS a bakteriális kromoszómától függetlenül replikálódik.
a plazmidokat valójában a DNS rövid szegmenseinek sok másolatának előállítására használják. Mivel a baktériumok gyorsabban replikálódnak, mint bármely más organizmus, az érdeklődésre számot tartó gén sok példányát előállíthatjuk, ha beillesztjük a bakteriális plazmidba.
az F-plazmid, a Col-plazmid, a degradatív – plazmid és a rezisztencia plazmid a baktériumokban található plazmidok számos gyakori típusa.
ezenkívül a plazmid molekuláris hordozóként működhet, amely rövid DNS-szegmenseket továbbít az egyik sejtből a másikba.
egy csodálatos mélyreható cikket írtunk le a plazmid DNS-ről. Olvassa el itt: plazmid DNS-szerkezet, funkció, izolálás és alkalmazások.
a bakteriális plazmid DNS szerkezete, a replikáció eredete, az antibiotikum rezisztencia gén, a promoter és az érdekes gén.
a baktériumokon kívül számos más prokarióta is tartalmaz plazmid DNS-t. A plazmid fő funkciója a baktériumokban a túlélésük a kemény körülmények között.
mivel a plazmid átadja az érdeklődésünkre számot tartó gént, nagyon fontos meghatározni, hogy az érdeklődésre számot tartó génünk be van-e helyezve a plazmidba.
ehhez számos módszert használhatunk, például PCR-t és mikrobiális tenyésztést.
a telepek Plattírozása több időt vesz igénybe, és a módszer érzékenysége sem jó. A fertőzés esélye mindig magas a baktériumtenyésztési módszerekben.
tehát az eredmények nem pontosak.
a PCR itt is segít. A kolónia PCR módszerével meghatározható vagy azonosítható egy DNS-betét.
- Hogyan hozzunk létre egy DNS-extrakciós laboratóriumot: átfogó útmutató (vegyi anyagok, műszerek és egyéb segédprogramok).
- 6P kromoszóma deléció: nincs fájdalom, nincs éhség és nincs alvás
mi a kolónia PCR?
a kolónia PCR a hagyományos PCR módosítása, amelyben a baktériumtelepeket közvetlenül PCR sablonként használják.
a plazmid DNS-t, amely tartalmazza a DNS-t érdeklődésünk felerősödik a ciklikus-hőmérséklet függő körülmények között.
a kolónia PCR grafikus ábrázolása az alábbi ábrán látható,
a kolónia PCR módszerének általános áttekintése.
a kolónia PCR elve:
a plazmidot tartalmazó baktériumtelep közvetlenül amplifikálható két alapozó készlet segítségével. Az inszerciós szekvenciát amplifikáló inszertációs specifikus primerek és a vektorspecifikus peremindexek, amelyek az inszertált DNS-től eltérő plazmid DNS-t amplifikálják (az inszertálás mindkét oldalán található peremrégiók).
az insert Peremező primerek használatával (amelyek felerősítik a DNS többi részét) meghatározható a DNS-betétünk mérete.
egy baktériumtelepet szedünk, és közvetlenül az összes PCR-reagenst tartalmazó mastermixbe adjuk. Ezenkívül egy kezdeti hevítési lépés hozzáadásával a PCR-hez a plazmid DNS kijön a baktériumsejtből, és a reakcióban felerősödik.
ez a kolónia PCR alapelve, azonban a követelményektől függően módosítható.
a kolónia PCR protokollja:
a kolónia PCR a hagyományos PCR egyik kiváló módosítása. A sablon DNS helyett a baktériumtelepeket közvetlenül hozzáadják a reakcióhoz. Emellett a PCR reakcióban Taq DNS polimerázt, primereket, PCR reakciópuffert és DD/W-t is hozzáadunk.
itt a kolónia PCR-ben a primerek kiválasztása nagyon fontos. A primerek kiválasztása a kísérletünk céljától is függ.
milyen típusú információt akarunk a kolónia PCR kísérletéből?
-
-
- információ csak a betét jelenlétéről vagy hiányáról.
- információ a betét méretéről.
- információ a betét tájolásáról.
-
attól függően, hogy a kolónia PCR-hez különböző PCR-alapozókat terveztek.
az insert specifikus primerek az érdeklődésünkre szolgáló beillesztett DNS mindkét oldalán lévő specifikus helyhez kötődnek. Ha megfelelően átkerül a plazmidba, ezek a primerek kötődhetnek hozzá, különben nem tud kötődni.
ez az alapozó készlet információt nyújt a betét jelenlétéről vagy hiányáról.
az orientáció-specifikus primerek olyan egyedi primerek, amelyekben az egyik primer kötődik a betét belsejében, egy másik primer pedig a plazmid DNS-szekvenciához (a betét DNS-től eltérő szekvencia).
az ilyen típusú alapozókészletek információt nyújtanak az érdeklődésünkre szolgáló beillesztett DNS orientációjáról. Ha az inszertált DNS – ünk nincs megfelelően lekötve a vektorba, akkor a szekvenciának erre az oldalára jellemző primer nem tud megkötődni, és nem kapjuk meg az amplifikációt.
a plazmid specifikus primerek ugyanolyan fontosak, mint az orientáció-specifikus primerek. Ezt az alapozókészletet a betét szélső régiójából tervezték, amely az érdeklődésünk szerinti DNS külső részéhez kötődik.
ez a primer készlet segít meghatározni a betét méretét. Kiterjeszti a DNS beillesztésén kívüli régiókat.
a kolónia PCR végrehajtására szolgáló PCR reakció a következő,
| komponens | koncentráció | mennyiség |
| Master mix (speciális
a Colony PCR-hez) |
1X | 12 ons |
| PCR reakciópuffer
2 mm-es MgCl2-vel* |
1X | 5 ons |
| előremenő alapozó | 10pM | 1 ons |
| fordított alapozó | 10pM | 1 ons |
| felülúszó | 3 ons | |
| víz | 3 ons | |
| összesen | ——— | 25 ons |
a kolónia PCR eljárása:
Nos, a kolónia PCR – nek nincs szüksége extrahált DNS-re.
itt nem vonunk ki DNS-t. Ehelyett számos más módszert alkalmaznak a reakció érzékenységének növelésére.
Ok, miért nem vonjuk ki a DNS-t a plazmid DNS-hez?
mivel az ok egyszerű, a baktériumsejt sejtmembránja nagyon sima.
már megvitattuk a baktériumsejt sejtmembránját. Olvassa el itt: Különböző típusú DNS-extrakciós módszerek
a baktérium lágy sejtmembránt tartalmaz, amely könnyen lizálható nagy sebességű hevítéssel vagy centrifugálással.
továbbá nincs szükségünk a bakteriális saját DNS-re. A keringő körkörös plazmid jelen van a baktériumok citoplazmájában, ezért további tisztítási lépésekre nincs szükség. A sejtmembrán felszakításával a sablon DNS készen áll az amplifikációra.
Ok, lehetővé teszi, hogy gyorsan megy keresztül a módszer megszerzése jó plazmid DNS.
a steril szedő segítségével válasszon ki több baktériumtelepet, és vigye át az Eppendorf csőbe.
most adjunk hozzá Te puffert, és jól keverjük össze. Használhatja a D / W-t is.
melegítsük a mintát forrásban lévő vízfürdőben 20 percig.
finoman vertex azt.
centrifugálja a mintát nagy sebességgel 2 percig.
helyezze át a felülúszót egy másik csőbe, és használja DNS-mintaként.
a reakcióba 20 6L-es mintát adunk.
További információ:
miért felülúszó és nem pellet?
a DNS az élet biomolekulája. A plazmid DNS még kisebb, mint a bakteriális nukleáris DNS. Csak több gént tartalmaz, legfeljebb 1000bp – től 20 000 bp-ig.
ezért csak centrifugálással a könnyebb plazmid DNS jön ki a sejtből, és leülepszik a felülúszóban, miközben a pellet fehérjéket és nukleáris DNS-t tartalmaz, így nem használjuk.
most jön a lényeg.
plazmidunk készen áll az amplifikációra.
egy másik módszerben
használja közvetlenül a baktériumtelepet.
ez a módszer a Hotstart PCR és a colony PCR kombinációja.
a baktériumtelepeket leszedik és hozzáadják a PCR reakciócsőhöz.
a csöveket a PCR gépbe helyezzük. Egy további fűtési lépés kerül hozzáadásra.
5-7 perces melegítéssel a plazmid DNS kijön a sejtből.
most az insert-specifikus primerek felerősítik a behelyezett DNS-t. És a szegélyező primerek felerősítik a DNS többi részét.
az erősítés 20-25 cikluson keresztül történik. A kolónia PCR ciklusfeltételeit az alábbiakban soroljuk fel,
| PCR lépések | kezdeti denaturálás | denaturálás | lágyítás | kiterjesztés | végső kiterjesztés |
| hőmérséklet | 95 oC | 95 oC | 55-65 oc | 72 oc | 72 oc |
| idő | 3 perc | 10 másodperc | 45 másodperc | 50 másodperc | 5 perc |
| ——- | ——- | 25 ciklusok | —– | ——- |
olvassa el az érdekes cikket a hagyományos PCR – ről: a polimeráz láncreakció teljes útmutatója
fejlesztési tippek:
csak néhány telepet használjon, mivel sok Telep növeli a nem specifikus kötések esélyét.
használjon pozitív kontrollt és negatív kontrollt.
pozitív kontrollként a szegélyező alapozót akkor is alkalmaztuk, ha a betét nincs jelen, a PCR reakció a plazmid DNS DNS-sávját adja, ami azt jelzi, hogy az általunk készített reakció helyes.
negatív kontrollként használja a nem átalakított plazmidot (plazmid inszertált DNS nélkül), ez a plazmid DNS csak akkor amplifikálódik, ha a betét jelen van.
mivel az insert rövid DNS-szekvenciákat használ, a hosszabb DNS-szekvenciák növelik a nem specifikus kötések és a PCR-reakció sikertelenségének esélyét.
továbbá használjon rövidebb PCR programokat.
a kolónia PCR fő alkalmazása a helyes ligálás és az inszertált DNS baktériumokba, valamint élesztő plazmidba történő beillesztése.
a kolónia PCR reakciójának befejezése után a PCR termékeket a 2% – os agaróz gélen futtatjuk. A kísérlet eredményeit az alábbi ábra mutatja,
most gondosan figyelje meg az eredményeket, az M A 3000bp molekuláris DNS marker. Tegyük fel, hogy az érdeklődésünkre szolgáló DNS, az” insert ” egy 400bp fragmentum, amelyet a plazmidba helyezünk.
lásd a 2.sávot: a lapkánk 400 bp-os töredéke.
a lapka mindkét oldalától 100bp szélső alapozókat terveztünk. Ha a szegélyező alapozó felerősíti a DNS-t a betéttel együtt, akkor a termék 600 bp, lásd a 3 sávot (400 BP insert DNS + 200 bp szélső régió).
most, lásd az 1. sávot, ez pozitív kontroll a betét nélkül vagy normál plazmid a transzformált DNS nélkül. Ezért a szegélyező primerek csak 200 bp DNS-t amplifikálnak.
Lásd az 1. sávot, a DNS 200bp fragmensét betét nélkül (pozitív kontroll).
most figyeld a 4-es sávot. A 4. sáv az orientáció-specifikus alapozók eredményei. A tájolásspecifikus alapozó a lapkaspecifikus alapozó és a szélső régióspecifikus alapozó kombinációja.
egy primer az insert DNS-ből és egy primer a peremterület-specifikus primerből kerül kiválasztásra az orientáció-specifikus primer erősítéshez.
ezért 100 bp fragmentumot erősítünk a határoló régió primeréből és 400 BP-t az insert DNS-ből, és 500 bp DNS fragmentumot figyelünk meg a 4.sávban.
az 5. sáv az insert specifikus kontroll, amely 400 bp DNS-fragmentumot ad.
Lane 6 a negatív kontroll nélkül a sablon. Negatív kontroll alkalmazásával bármilyen szennyeződés azonosítható. A reakciócső a sablon kivételével az összes összetevőt tartalmazza. Tehát ideális esetben ebben a sávban nincsenek DNS-sávok.
ha DNS-sávot észlelünk, a minta szennyezett.
a kolónia PCR előnyei:
- a technika gyors és költséghatékony.
- továbbá a technika pontossága és specifikussága magasabb.
- a beállítás egyszerű, mint a hagyományos PCR, DNS extrakció és plazmid Tisztítás, mint a fáradságos lépések nem szükségesek.
- nincs szükség restrikciós emésztésre az inszertált DNS azonosításához.
- az egész kísérlet 90 percen belül befejezhető.
a kolónia PCR hátrányai:
- a módszer költséghatékony, gyors és megbízható, azonban a betétben semmilyen mutáció nem mutatható ki.
- ezenkívül a szekvencia információ nem nyerhető a kolónia PCR – vel. szekvenálást kell végeznünk a DNS transzformáció megerősítéséhez.
- a hamis pozitív eredmények esélye magas.
Olvass tovább;
- mi az a multiplex PCR?
a kísérlet befejezése után a mintát elküldjük a szekvenáláshoz, ahol meghatározható az érdeklődésünk szerinti DNS-szekvencia.
akár multiplex PCR-t is végezhetünk mind az insert specifikus primerek, mind a plazmid-specifikus primerek kombinálásával.
következtetés:
bár a kolónia PCR a legjobb választás a géntranszfer azonosításához, az egyetlen kolónia PCR technika nem elegendő az eredmények értelmezéséhez. Lehetséges, hogy néhány mutáció jelen van a betét, hogy nem lehet kimutatni a PCR.
az eredmények megerősítéséhez DNS-szekvenálás szükséges. A szekvencia sorrendjének meghatározása után elmondhatjuk, hogy az érdeklődésre számot tartó génünk helyesen van-e behelyezve vagy sem.
