Fertőző nekrotikus hepatitis által okozott Clostridiumnovyi B típusú egy ló: esettanulmány és review ofirodalom | Jiotower

fertőző nekrotikus hepatitis (INH) okozta Clostridium novyitype B. a betegség jellemzően érinti juhok, amelyben azt is nevezik”fekete betegség”, mivel a sötét elszíneződés a bőr alatti szövet által okozott intenzív vénás torlódás látható a tetemek ebben a betegségben elpusztult állatok.6 bár úgy gondolják, hogy az INH más fajokban is előfordul, beleértve a szarvasmarhákat, a kecskéket és a lovakat, nagyon kevés információ áll rendelkezésre erről a betegségről a juhokon kívüli állatokon kívül.2,3,19,15 továbbá szigorú anaerob jellege miatt a C. novyi B típusú izolálása és azonosítása ritkán történik meg.15 emiatt az INH-ról szóló jelentések általában a hisztopatológián, fluoreszcens antitest teszten (FAT) és/orimmunohisztokémián (IHC) alapuló feltételezett diagnózisra korlátozódnak. A C. novyi típusa ritkánmeghatározott. Itt bemutatjuk a C által okozott lóinh megerősített esetét.novyi B típusú, valamint áttekinti a szakirodalom a betegség.

egy 14 éves, 511 kg-os bay Quarter ló herélt ló került benyújtásra a San Bernardinobranch of the California Animal Health and Food Safety Laboratory System forpostmortem vizsgálat és diagnosztikai munka. Az állatnak 3D-s kórelőzményében progresszív neurológiai tünetek voltak, a végbél hőmérséklete 38,8-40,5 C volt, és a halál előtt nem szteroid gyulladáscsökkentő szerekkel sikertelenül kezelték.A teljes boncolást ~6 órával a halál után végezték el.

a boncoláskor a ló jó táplálkozási állapotban volt, megfelelő mennyiségű zsírtartalékkal, és mérsékelt állapotban volt a halál utáni bomlás. Sárga volt a sclera, a szubkután és a zsírszövet, valamint az articularcartilages elszíneződése. A legtöbb esetben multifokális ecchymotic-to-suffusive vérzés volt jelenaz izmok, a bélrendszer szerosa, a mesentery, a lép, a pleura, a szívpapilláris izmai. A vénás vér mély vörös-fekete volt. A pericardialsac kitágult nagy mennyiségű szeroszangvinikus folyadék, és volt ~5L hasonló folyadék tartalmazó bőséges fibrin szálak a hasüregben.A máj jelentősen megnagyobbodott és lekerekített élekkel rendelkezett; a bal lebeny szilárd,sötétvörös vagy fekete színű volt, és számos subcapsularis és mély parenchymás gázbuborék és bőséges fibrin volt a kapszula felett (ábra. 1A). Ennek a lebenynek a vágott szakaszán ~15 cm átmérőjű, halvány terület volt, amelyet vékony vérzéses perem vett körül (ábra. 1B). Az agyat és a gerincvelőt borító agyhártyák diffúz módon túlterheltek voltak, és petechiális vérzések voltak az agykéregben. A hasított test többi részén más jelentős súlyosságot nem figyeltek meg.

agy -, tüdő -, szív -, rekeszizom -, máj -, lép -, gyomor -, bél -, hasnyálmirigy -, mellékvese -, bél -, vese-és húgyhólyagmintákat gyűjtöttünk és rögzítettünk 10% – os pufferolt formalinban (pH 7,2) 48 órán keresztül, és rutinszerűen dolgoztuk fel a 4 db-os hematoxilin-és eozin – (H&e) – foltos szakaszok előállításához. A máj és a vese szakaszokat Gram és Okajima foltokkal is festették.

a májmintákat aszeptikusan gyűjtöttük, és aerob és anaerob tenyésztésnek vetettük alá 5% juh agarlemezeken 48 órán keresztül. PCR-t végeztek a nyugat-nílusi vírus (WNV)esetében a központi idegrendszer összesített mintáin, valamint a lófélék herpeszvírusának 1 (EHV-1) esetében egy orr-tamponon. A májmintákon nehézfémszűrőt végeztek, amely ólmot, mangánt, vasat,higanyt, arzént, molibdént, cinket, rézt és kadmiumot tartalmazott.Cerebrospinális folyadék teszteltük elleni antitestek Sarcocystisneurona segítségével közvetett zsír. A májkeneteket FATfor Clostridium chauvoei, Clostridium septicum,Clostridium sordelli és C. novyi dolgozta fel kereskedelmi konjugátumok (VMRD, Pullman, WA) felhasználásával. Ezenkívül a máj formalin-rögzített,paraffinba ágyazott részeit közvetett immunoperoxidasetechnique feldolgozta C. novyi, kereskedelmi készlet felhasználásával (RTU VECTASTAINElite ABC rendszer, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Az endogén peroxidázaktivitást 3% – os hidrogén-peroxid oldattal eloltottuk, ezt követően pepsintreatment antigén visszakeresésre. A mintákat ezután inkubáltuk Backgroundpunisherrel (Biocare Medical, Concord, CA) a nem specifikus kötés blokkolására, kecske anti–C. novyi poliklonális antitesttel (VMRD) történő inkubálás előtt 37 kb 60 percig. A vizualizációhoz Vektor NovaRED kromogént használtunk (VectorLaboratories). A máj szakaszai normál kecske szérummal inkubáltakelsődleges antitesteket használtunk negatív kontrollként. Máj egy tehénből, amelybenc. a novyi-t tenyésztéssel azonosították, és a PCR-t pozitív kontrollként alkalmazták.

a májmintákat a gyártó utasításainak megfelelően feldolgoztuk DNS-extrakció céljából (QIAamp DNS FFPE tissue kit, Qiagen,Hilden, Németország). Az extrahált DNS-t sablonként használták egy multiplex PCR vizsgálathoz a C. septicum, C. novyi a, C típusú flagellingének (fliC) szegmenseinek amplifikálására. chauvoeiés Clostridium haemolyticum, amint azt korábban leírtuk.17 ezenkívül kifejlesztettünk egy hagyományos PCR-t a theC egy szegmensének amplifikálására. novyi B típusú alfa toxin(Tcns) gén (GenBank csatlakozás JENV01000127.1), Ennek fő virulencia tényezőjemikroorganizmus. A következő oligonukleotid szekvenciákat tervezték:5′-Tgatgttgaccatccttgctct-3′ (CNtBaF) és 5′-CCTTATGCAAAGGGATGGCG-3′ (CNtBaR),amelyek a célgén ~342-bp DNS-fragmensét amplifikálják. A hagyományos PCR-t teljes térfogatban végeztük el 25 a kivont DNS-t tartalmazó 5 a 0.Mindegyik primer 25 (10), 7(7) (nukleázmentes víz) és 12,5(2x) (Promega, Madison, WI), Taq DNS polimerázt (pH 8,5, 50 E/mL), dNTPs-T (400) és MgCl2-T (3 mM) tartalmazó PCR mesterkeverék. A thermocycler profilok a következők voltak: 94 C 6 percig, 30 ciklus 94 C 1 percig, 55 C 1 percig, és 72 C 1,5 percig, majd egy utolsó hosszabbítási lépés 72 C 7 percig. A mintákat 4 db-On tartottuk Cuntil a PCR reakciókat ultraibolya fényben etidiumbromid (Amresco, Solon, OH)-festett 1% agaróz gélekben (Agarose SFR, Amresco) vizualizáltuk. C-ből kivont DNS. pozitív kontrollként novyi B típusú (ATCC 25758), C. novyi a típusú, C. septicum, C. chauvoei és C. haemolyticum tenyészetet használtunk. A DNS helyett vizet használtunk negatív kontrollbanreakciókat.

mikroszkóposan a májkapszulát bőséges fibrin borította celldebrisszel keverve, és különböző méretű subcapsularis és mély parenchymás emphysematous bullae volt. A legszembetűnőbb megállapítás a multifokális vagy fokálisan extenzív koagulatív nekrózis volt, amelyet nagyszámú életképes anddegenerate neutrofil perem, vérzés, fibrin, sejttörmelék és nagy aggregátumok vettek körülgram-pozitív baktériumrudak, amelyek közül néhány szubterminális spórákkal rendelkezett (ábra. 1C, D).D). A beavatkozáskorparenchyma és a kevésbé érintett májban epe stasis, multifokális vérzés és szegmentális-diffúz fibrinoid nekrózis volt az erekben, amelyek közül sok fibrin trombit is tartalmazott. A renális tubuláris epithelium enyhe citoplazmatikus vakuolizációt mutatott, és fehérje és szemcsés gipszek voltak jelen a vesetubulusok lumenében. Az öntvények pozitívan festettek Okajima folttal (ábra. 1E). Az agyban diffúz torlódás,multifokális és véletlenszerűen szétszórt perivaszkulárisvérzések, valamint a Virchow-Robin tér mérsékelt vagy jelentős kiterjedése voltacidofil ödéma. A visceralis peritoneumot bőséges fibrin borította, amelyet nagyszámú életképes és degenerált neutrofilnel kevertek össze; a legtöbb peritoneális véredény túlterhelt volt és / vagy fibrin trombitákat tartalmazott. Néhány kisebb artéria ésvénák a mellékvese kéregében és medullájában szintén fibrin trombusok voltak. Aplinnek érd-torlódása és multifokális parenchymás és capsularis vérzése volt. A tüdő diffúz módon túlterhelt volt, multifokális vérzései és ödémája volt, néhány fibrin trombust tartalmazó véredény mellett. Multiplesubendocardialis, subepicardialis és subpleuralis vérzést észleltek.

a májban megfigyelt intralesionális gram-pozitív rudak nagy többsége pozitív volt a C. novyi IHC-re (ábra. 1F). A zsír pozitív volt C-re.novyi, de negatív a többi vizsgált klostridialis faj esetében. A májminták pozitívak voltak a C. novyi B típusú flicés Tcns gének szempontjából, negatívak pedig a többi vizsgált clostridia fliC génjei szempontjából (ábra. 2). A cerebrospinális folyadék mintái negatívak voltak az S. neurona immunfluoreszcens antitest vizsgálat szempontjából. A WNV és EHV-1 PCR-je negatív volt. Aerob vagy anaerob tenyésztéssel nem sikerült szignifikáns baktériumnövekedést elérni. A nehézfém képernyő megnövekedett vaskoncentrációt mutatott bemájminták (1500 ppm; referencia intervallum: 100-300 ppm).

az INH feltételezett diagnózisát bruttó és mikroszkopikus változások alapján készítettük, a C. novyi FAT és IHC eredményeivel párosítva. A C. novyi B típusú INH diagnózisát a mikroorganizmus fliC és Tcns génjeinek PCR kimutatásával igazolták. Tudomásunk szerint csak 6 IHN-gyanús esetet jelentettek. korábban lovakban. Három eset történt Ausztráliában,8,9,11 és egy-egy Új-Zélandon,23 Skóciában,19 és az Egyesült Államokban (Montana).16 ezekben az esetekben a feltételezett diagnózis gross és mikroszkopikus elváltozásokon alapult, a C. novyi FAT,9,16,19 IHC,23 és/vagy tenyészet által történő kimutatásával párosulva.9,19 az érintett C. novyifajtát azonban egyik esetben sem határozták meg.

a C. novyi egy gram-pozitív, spóraképző, anaerob bacillus,amely gyakran megtalálható az állatok talajában és ürülékében.15 az A, B és C típusokba sorolják a termelt toxinok tartománya alapján.4C. az a típusú novyi elsősorban a halálos, ödémát kiváltó alfatoxint (Tcns) és a nem halálos foszfolipázt, a gamma toxint termeli; ez a baktérium az emberek és állatok gázgangrénjéhez kapcsolódik, általában más klostridiumokkal együtt hat. A C. novyi B típusú Tcns-t is termel, a nekrotizáló és hemolitikus béta-toxin mellett, bár az előbbit az INH patogenezisében a legfontosabb virulencia faktornak tekintik. C. novyi C típusú tekinthető nem toxigén ésnem patogén.13,15 C. A haemolyticum korábban C néven volt ismert. novyitype D, és néhány szerző még mindig ezen a néven hivatkozik rá; ezért itt is tárgyaljuk ezt a mikroorganizmust. A C. haemolyticum béta-toxint is termel, de sokkal nagyobb mennyiségben,mint a C. novyitype B; ezt a toxint tekintik ennek a mikroorganizmusnak a fő virulencia faktorának, és felelős a bacilláris hemoglobinuriáért (BH), amely elsősorban a szarvasmarhákat érintő betegség, amely klinikailag és kórosan nagyon hasonló az INH-hoz.11,10,14

a spórák a C. a novyi rendkívül ellenálló a környezeti feltételekkel szemben, és mivel a spórák gyakran megtalálhatók a talajban, a legelő állatok gyakran elfogyaszthatják őket.6,19 bár nem teljesen bizonyított, a jelenlegi dogma az, hogy lenyelés után a C. novyi B típusú spórák felszívódnak a bélből, és a portális keringésen keresztül jutnak el a májba, majd más szervekbe terjednek. A spórák fagocitizálódnak, és látens állapotban maradnak a máj Kupffersejtjeiben, valamint a lép és a csontvelő makrofágjaiban.A 2,6 INH-t gyakran a BH megfelelőjének tekintik, mivel úgy gondolják, hogy mindkét betegség májkárosodás után következik be, ami nekrózist és a látens spórák csírázásához és a toxintermeléshez szükséges anaerob állapotokat okoz.14 a Fasciola hepatica éretlen formáinak Migrációjaa májat mind a BH, mind a kérődzők legfontosabb hajlamosító tényezőjének tekintik, és mindkét betegség gyakoribb a fascioliasis magas prevalenciájú területein.1 INH kérődzők is társult Cysticercustenuicollis és más paraziták, beleértve Fascioloidesmagna, Dicrocoelium dendriticum, ésthysanosoma actinoides, 2,6,15,21 bár a szerepe ezek a paraziták a patogenezisében a betegség nem igazolták.Az anaerob állapotok kialakulásához vezető bármilyen májkárosodás azonban az INH-ra hajlamosító tényező lehet. Ezek közé tartozik, de nem kizárólagosan, májabscesses, biopsziák, zsíros változás, telangiectasia, toxikus anyagok. Miután a Tcns-t előállították és felszabadították a C vegetatív formái. a Novyi B típusú monoglikozil-transzferáz aktivitása inaktiválja a guanozin-5 ‘ – trifoszfát (GTP)-kötő fehérjéket a gazdasejtekben, ami az aktin citoszkeleton megváltozását és újraelosztását eredményezi.3 A Tcns a vimentin és a tubulin rendszert is megzavarja.7,18 úgy tűnik, hogy ezek a változások drámaibbak a kapilláris endotheliumban, ami az INH15-ben tapasztalt széles körben elterjedt folyadék extravazációhoz és valószínűleg a jelentésünkben szereplő lóban megfigyelt multiszisztémás trombózishoz vezet. Juhoknál a betegség rendkívül akut jellege miatt a klinikai tünetek nehezen észlelhetők, az állatokat általában halottnak találják. Olyan esetekben, amikor jelekmegfigyelhetők, nem specifikusak, gyengeség, letargia,anorexia, hipertermia, tachypnea, hyperpnea, végül recumbency. A klinikai patológiai változások közé tartozhat a bal oldali eltolódású neutrophilia,azotemia, metabolikus acidosis és emelkedett máj-és izomenzim aktivitás.15,19

tekintettel arra, hogy lovakban korábban csak 6 feltételezett INH esetet írtak le, a rendelkezésre álló epidemiológiai, klinikai és patológiai információk szűkösek. E korlátozott számú eset alapján a lófélék esetében nincs nyilvánvaló nemre vagy fajtára való hajlam, és ez mind a fiatal, mind a felnőtt állatokat érintheti. A klinikai lefolyás lovaknál általában hosszabb, mint kérődzőknél, 12-72 óráig tart, és az eredmény mindig végzetes volt. A klinikai tünetek az enyhétől a súlyosig terjednekdepresszió és mozgási hajlandóság, neurológiai tünetek, beleértve az ataxiát és a headtiltot, hyperaemiás és/vagy ictericus nyálkahártya és ocularis sclera, hasi fájdalom és recumbency.20,23 egy esetben, amikor abdominocentesist végeztünk, megnövekedett mennyiségű zavaros folyadék emelkedett fehérjekoncentrációval ésspecifikus gravitációt kaptunk.9

az INH-ban szenvedő lovak klinikai patológiai profilja nagyon változó, és a toxémia és a májkárosodás különböző stádiumait jelentheti. Ezek a változások magukban foglalhatják a bal oldali eltolódású neutrofiliát,az emelkedett májenzimaktivitást, a thrombocytopeniát, a hyperfibrinogenémiát, a hyperbilirubinémiát és az elektrolitok csökkent koncentrációját.9,16,19 ezenkívül emelkedett aktivált parciális tromboplasztin -, protrombin-és trombin-időket jelentettek.23 ezek a változások a megfigyelt kapilláris mikrotrombákkal együtt a disszeminált intravascularis koagulációra utalnak, amely folyamat Nagytestű állatoknál valószínűleg a toxémia és hemolízis során következik be.22,23 a véralvadási faktorok fogyasztása, csökkent szintézisük a májelégtelenség miatt, valamint a tcns vaszkuláris endotheliumra gyakorolt szinergikus hatása feltételezhetően felelős az INH eseteiben megfigyelt széles körű vérzésekért.

bár az icterust kérődzőknél nem írják le, a lovak néha ezt az INH-val társított jelet mutathatják.19,23 úgy tűnik, hogy az Icterus összefügg a májkárosodás súlyosságával, és bizonyos mértékig a hemolízissel, mint a mi esetünkben, amelyben a hemoglobint Okajima folt vizualizálta a vese tubulusokban. A ló a ourstudy mérsékelten emelkedett vas koncentrációja a májban, ami ahemolitikus folyamatra utal.5 a májban található vas szintje azonban gyakori lelet a különböző okok miatt elhaló lovaknál, és gyakran mellékes lelet, amely a torlódással és a halál utáni autolízissel függ össze (a szerzők nem publikált megfigyelése).

bár feltételezhető, hogy a lovak érzékenyebbek, mint más fajoka C. novyitype B által termelt hemolitikus béta-toxin hatására a hemoglobinurikus változásokat nem írták le azinh feltételezett eseteiben.16,23 a C. haemolyticumhoz képest a B típusú C. novyi alacsonyabb béta-toxint termel;15 ezért feltételezhető, hogy hozzájárul az INH patogeneziséhez, ami bizonyos fokú hemolízist okoz a lovakban, de nem elegendő ahhoz, hogy jelentős hemoglobinuriával kapcsolatos változásokat idézzen elő. Ezenkívül az előző esetek egyike sem zárta ki a C. haemolyticum szerepét a betegség okozójaként, ezért ezekből az esetekből nem lehet végleges következtetéseket levonni. A C. haemolyticum szerepet játszott a szeptikus peritonitis Ina mare esetében a MALDI-TOF-szal való azonosítással; a PCR vagy a toxin azonosítását azonban ebben az esetben nem próbálták meg.11

lovaknál az INH-ra hajlamosító tényezőt nem mindig határozták meg, bár javasolták az F. hepatica és a rokon trematodes, valamint a Strongylidae család tagjainak májvándorlását.9,12,19 ezenkívül a klinikai tünetek megjelenése előtt anthelmintikus kezelést javasoltak a betegség lehetséges kiváltó okaként,9,16,23 feltehetően bizonyos fokú máj nekrózis okozásával, amely a vándorló paraziták pusztulásával jár. Ennek a hipotézisnek a alátámasztására azonban nincs tudományos bizonyíték. Sajnos nem ismerta mi esetünkben meghatároztuk a hajlamosító tényezőket.

mint a mi esetünkben, a legtöbb korábbi jelentés egyetlen (egy esetben többszörös19) a májat érintő nekrózis fókuszát írta le, amely következetesen a bal oldali lebenyben helyezkedik el. Ez ellentétben áll a juhok INH-jával, amelyekben véletlenszerűen elosztott, kicsia nekrotikus gócok gyakoribbak.6,15 ennek okaaz Eloszlás variációja ismeretlen. Lehetséges, hogy a bal oldali lebeny sérüléseinek túlsúlya az úgynevezett portális áramláshoz kapcsolódik, amelyfelelős a portális vér differenciális áramlásáért a máj egyes lebenyeihez. Mivel a C. novyi feltehetően a vékonybélből szívódik fel, és ebből a szervből a vér a bal lebenybe áramló portált követi, ez azt eredményezheti, hogy ez a lebeny túlnyomórészt érintett.6 a hepatikus encephalopathiával összefüggő változások hiánya (pl.Típusú astrocytosis társított hyperammonemia) 6 arra utalhat, hogy a neurológiai tünetek ebben és a korábbi esetekbenaz agyban észlelt vérzések, torlódások és perivaszkuláris ödéma következménye, amely a toxémiához és a tcns kapilláris endotheliumra gyakorolt hatásához kapcsolódik.

az INH-nak szerepelnie kell a neurológiai tünetekkel rendelkező lovak differenciáldiagnózisának listájábanklinikai tünetek, toxémia, akut májelégtelenség, peritonitis. Annak ellenére, hogy a penicillin és tetraciklinek nagy dózisú kezelése hatékony lehet A C ellen. novyi, a toxinok fejlett termelése általában eredményezrossz prognózisban.19 azokon a területeken, ahol a betegség egyértelműen összefügg a májflukával és/vagy más parazitákkal, megelőző intézkedésként meg lehet kísérelni a parazita terhek csökkentését és az állatok rossz vízelvezetésű legelőkhöz való hozzáférésének korlátozását.15

tekintettel arra, hogy számos klostridialis betegség feltételezhetően összefügg a halál utáni gyors bomlással, az INH helyes diagnózisának fontos szempontja a szövetek gyors értékelésének és megőrzésének szükségessége az állat halála után.6,23 a klinikai anamnézis, a rutin boncolás,a kórszövettan és a C. novyi immunfestése májléziókban elengedhetetlenek az INH feltételezett diagnózisának biztosításához. Mivel az izolálás nem mindig sikeres, tekintettel a mikroorganizmus szigorú anaerob követelményeire, a PCR-rel történő molekuláris azonosítás értékes eszköz az etiológiai diagnózis biztosításához, valamint a C. novyi B típus megkülönböztetéséhez más clostridial kórokozóktól.