A kvantitatív citomegalovírus DNS-vizsgálat értelmezése: a laboratóriumi perspektíva megértése | Jiotower
analitikai vizsgálati jellemzők
a vírusterhelési teszteknek vannak olyan teljesítményjellemzői, amelyeket meg kell érteni a vizsgálati eredmények megfelelő felhasználása és értelmezése érdekében. Ezek közé tartozik a detektálási határ (lod), az alsó és a felső LOQ, a lineáris tartomány, a pontosság (reprodukálhatóság) és a pontosság. A LOD-t , amelyet a DNS legalacsonyabb koncentrációjaként határoznak meg, amely a replikációk 95% – ában kimutatható, általában kvalitatív molekuláris vizsgálatokhoz használják; a kifejezés azonban alkalmazható kvantitatív vírusterhelési tesztekre is. A felső és az alsó Loq-k a legmagasabb és legalacsonyabb DNS-koncentrációk, amelyek “elfogadható pontossággal” számszerűsíthetők . Jelenleg nincs elfogadott meghatározás az “elfogadható pontosságra”; ezért az egyes laboratóriumok ezt helyben határozzák meg. Az “elfogadható pontosság” meghatározásának módja nagyban befolyásolhatja a LOQ-t. A LOD egyenértékű lehet az alsó LOQ-val, vagy alacsonyabb lehet, mint az alsó LOQ. Ez utóbbi esetben a teszt kimutathatja a CMV DNS-t, de az értéket nem lehet pontosan számszerűsíteni. Ezekben az esetekben a laboratórium az eredményt “észleltnek, de a LOQ alatt” jelentheti; egyes laboratóriumok ezt “alacsony pozitívnak” jelentik.”A laboratóriumnak képesnek kell lennie mind a LOD, mind a LOQ biztosítására; például laboratóriumunkban a CMV vírusterhelési teszt LOD 100 kópia/mL, míg a LOQ 300 kópia/mL. A klinikusokkal folytatott konzultációt követően úgy döntöttek, hogy a 100-300 kópia/mL értékeket “alacsony pozitív” eredményként jelentik, míg a >300 kópia/mL értékeket egész értékként jelentik.
bár a nagyon érzékeny molekuláris tesztek gyakran fontosak a fertőző kórokozók kimutatásához, a CMV DNS-tesztek esetében ez nem biztos, hogy így van. A CMV DNS alacsony szintjének klinikai jelentősége (<100-500 kópia/mL) nehéz lehet értelmezni, különösen, ha teljes vérmintákat tesztelnek, mert a CMV DNS alacsony szintje a teljes vérben vagy a plazmában nem mindig korrelál a betegség kialakulásával. Néhány vizsgálatot végeztek a kezelés küszöbének meghatározására ,beleértve a CMV betegség Természettudományi vizsgálatát májtranszplantált betegeknél. A Cobas Amplicor Monitor teszt (Roche Molecular Diagnostics) segítségével a szerzők kimutatták, hogy a 2000-5000 kópia/mL vírusterhelési érték korrelál a végszervi betegség kialakulásával. Ez a határérték tesztfüggő, és magasabb vagy alacsonyabb lehet más LDT-k esetében. Tanulmányok azt is kimutatták, hogy mind a vírusterhelés értéke, mind a vírusterhelés változásának mértéke fontos előrejelzője az aktív betegség kialakulásának . Minél gyorsabban növekszik a vírusterhelés értéke, annál nagyobb a CMV-betegség kialakulásának kockázata. Miután a teszteket újrakalibrálták a nemzetközi standarddal, egy univerzális, klinikailag releváns LOD és alacsonyabb LOQ azonosítható. A jelenleg rendelkezésre álló adatok és tapasztalatok alapján 250-500 NE/mL lehet megfelelő LOD és/vagy alacsonyabb LOQ.
tekintettel arra, hogy a legtöbb LDT valós idejű polimeráz láncreakció technológiákat alkalmaz, a CMV vírusterhelési tesztek lineáris tartománya általában legalább 6 log10; például a teszt 2,0 log10 kópia/mL-től (100 kópia/mL) 7,0 log10 kópia/mL-ig (10 millió kópia/mL) mutatható ki. Az Emory Medical Laboratories 2009-ben elvégzett CMV vírusterhelési tesztjének áttekintése azt mutatta, hogy a plazmamintákon végzett körülbelül 8500 CMV DNS vírusterhelési teszt közül 671 (7,9%) pozitív volt. Ezek közül 394 (58,7%) <1000 kópia/mL, 169 (25,2%) 1000-10 000 kópia/mL, és 63 (9,4%) 10 000-100 000 kópia/mL volt. Ezenkívül 45 (6,7%) CMV DNS vírusterhelése >100 000 kópia/mL volt. Bár az alacsony vírusterhelési értékek gyakoriak, klinikai jelentőségük nem világos. A nagyon magas vírusterhelési értékek nem gyakoriak, és amikor előfordulnak, általában immunszuppresszált, primer CMV fertőzésben szenvedő betegeknél vagy nagyon súlyos betegségben szenvedőknél fordulnak elő. Mivel a vírusterhelési értékek olyan magasak, mint 10 millió lehet jelen egyes egyénekben, a teszt mennyiségi meghatározásának felső határának ebben a tartományban kell lennie.
a longitudinális vírusterhelési értékek fontos különbségeinek értelmezése az egyes betegeknél megköveteli a teszt pontosságának vagy reprodukálhatóságának megértését. Általában a vírusterhelési tesztek variabilitása a legnagyobb az alsó és a felső LOQ közelében, és a legalacsonyabb a vizsgálat középső tartományában. Ennek eredményeként az alacsony vírusterhelési értékek kis változásai nem szignifikánsak; például nincs egyértelmű különbség az eredmények között egy olyan betegnél, akinél a vírusterhelés értéke 200 kópia/mL-ről 500 kópia/mL-re nőtt, mert ez a különbség a vizsgálat változékonyságán belül van. A vírusterhelési értékek klinikailag fontos változásaira vonatkozó leghasznosabb adatok a HIV-1 tapasztalataiból származnak. Ezen FDA által jóváhagyott tesztek esetében a teszt variabilitása 0,1 log10 kópia/mL-től 0,2 log10 kópia/mL-ig terjed, összehasonlítva a krónikusan fertőzött, kezeletlen egyéneknél megfigyelt biológiai variabilitással, amely körülbelül 0,3 log10 kópia/mL. Ezért úgy gondolják, hogy a >0,5 log10 kópia/mL vírusterhelés változása biológiailag fontos változásokat jelent a vírus replikációjában. Bár a 0,5-log10 kópia/mL értéket széles körben elfogadták sok más vírusos kórokozóval történő alkalmazásra, lehet, hogy nem pontos a CMV esetében. Mivel a CMV biológiai variációja nem ismert, a vírusterhelési értékek fontos változásait történelmileg csak a teszt variabilitása alapján értékelték. A HIV-1-vel végzett további munka azt mutatta, hogy a teszt SD-jének 0,15 log10 kópia/mL-nek kell lennie, hogy felismerje a vírusterhelési értékek 5-szeres változását . A CMV LDT-k esetében a vizsgálat variabilitása várhatóan nem lesz jobb, mint az FDA által jóváhagyott HIV-1 vírusterhelési teszteknél, és magasabb lehet, különösen az alsó LOQ közelében . Ezért a CMV vírusterhelési értékek <1000 kópia/mL kimutatásakor <5-szeres változások (0.7 log10) ritkán tükrözi a vírus replikációjának klinikailag fontos változásait. A >1000 kópia/mL értékek esetén a vírusterhelés 3-szoros (0,5 log10) változása jelentős lehet, bár ez eltérhet az LDT-k között. Egyes központok a vírusterhelést kópia/mL-ként és log10 kópia/mL-ként jelentik, mivel a klinikusok kevésbé valószínű, hogy túlértelmezik a vírusterhelési értékek kis változásait, ha log10 értékként fejezik ki.
a vírusterhelés tesztelésének kiindulási mintáját a CMV-kezelés megkezdésének napján kell összegyűjteni, még akkor is, ha a CMV vírusterhelés-tesztet néhány nappal korábban elvégezték. A CMV vírusterhelés gyors növekedése néhány nap alatt előfordulhat kezeletlen betegségben szenvedő betegeknél, ezért fontos a CMV vírusterhelés értéke a kezelés idején. Ha a vírusterhelési értékek meghaladják a felső LOQ-t, ajánlott, hogy a laboratórium hígítsa a mintát a tényleges vírusterhelés értékének meghatározásához. A terápia megkezdése után a monitorozás ideális intervalluma heti, mivel a CMV DNS felezési ideje a plazmában 3-8 nap . Ennek az intervallumnak a másik oka az, hogy nem ritka, hogy a CMV DNS vírusterhelése néhány nappal a kezelés megkezdése után növekszik a betegben, és ez félreértelmezhető a kezelés sikertelenségeként. Mivel a plazmában vagy a teljes vérben tartósan DNS-sel rendelkező betegeknél fokozott a visszaesés kockázata, a jelenlegi irányelvek azt javasolják, hogy folytassák az antivirális terápiát, amíg a vírusterhelési értékek nem mutathatók ki. Néhány betegnél tartósan alacsony a CMV DNS szintje a plazmában vagy a teljes vérben, és soha nem alakul ki CMV betegség vagy visszaesés. Ezekben az egyénekben hasznosabb a vírusterhelési értékek időbeli tendenciáinak követése, mint bármely adott vírusterhelési érték jelentőségének felmérése. A gyógyszerrezisztens vírus szempontjából aggasztó vírusterhelési minták közé tartoznak azok , amelyek nem csökkennek 2 hetes megfelelő terápia után, azok, akiknek fennsíkja van a vírusterhelés csökkenésének sebességében, és azok, amelyeknek kezdeti csökkenése, majd ezt követő növekedése van vírusterhelés terápia közben. Ezeknél a betegeknél az UL97 és/vagy UL54 (polimeráz) gének közvetlen plazmamintából történő szekvenálásával ki kell vizsgálni a rezisztens vírus jelenlétét.
a CMV DNS vírusterhelési teszteket úgy tervezték, hogy ne lépjenek keresztreakcióba más herpeszvírusokkal. Egy immunhiányos betegnél 2 herpeszvírus, például CMV és Epstein-Barr vírus kimutatása mindkét vírus reaktivációját tükrözi, és nem a keresztreaktivitásnak köszönhető.
