Arabidopsis cmt3 kromometiláz mutációk blokkolják a nem CG metilációt és egy endogén gén elnémítását | Jiotower

eredmények és megbeszélés

a WS PAI gének metilációját és elnémítását szabályozó tényezők azonosítása érdekében izoláltuk a WS mutáns változatát, a pai1C251Y-t, amelyben a metilezett szingulett PAI2 gén elnémítása megjeleníthető egy kék fluoreszcens növényi fenotípus intenzitásával ultra-Ibolya (UV) fény (bartee and Bender 2001). A pai1C251Y törzsben a Pai enzimaktivitás egyetlen lehetséges forrása a pai1 gén, amelyet egy missense mutáció megbénít, és a PAI2 gén, amelyet elhallgattatnak. Ennek a PAI-hiánynak köszönhetően a törzs fluoreszcens triptofán út köztitermékeket halmoz fel, valamint sárga-zöld levél pigmentációt, csökkent méretet, fokozott bozótosságot és csökkent termékenységet mutat. Azonban a második hely mutációi, amelyek enyhítik a PAI2 hangtompítását, elnyomják a PAI-hiányos fenotípusokat (Bartee and Bender 2001). Így mutagenizáltuk a pai1C251Y törzset, és megvizsgáltuk az elnyomott gyenge fluoreszcens fenotípusú palántákat. Másodlagos szűrőként a Pai metilezést Déli blot elemzéssel teszteltük metilációra érzékeny restrikciós enzimekkel. Konkrétan a metilációt a HpaII és MspI izoszkizomerekkel vizsgáltuk, amelyek felismerik az 5′-CCGG-3’szekvenciát. A HpaII érzékeny mind a belső (CG), mind a külső (CNG) citozinok metilációjára, míg az MspI csak a külső citozinok metilációjára érzékeny. Ezek az enzimek minden egyes WS Pai lókuszban egyszer hasadnak, és feltárják mind a sűrűséget, mind a metiláció mintázatát az egyes géneknél (Bender and Fink 1995; Luff et al. 1999; Melquist et al. 1999).

ebből a szűrési stratégiából 11 funkcióvesztést okozó allélt izoláltunk a CMT3 génben (lásd alább az anyagokat és módszereket). A pai1c251y háttér cmt3 mutánsai erősen csökkent fluoreszcenciát mutattak a korai palántafejlődésben és részben csökkent fluoreszcenciát a felnőtt növényekben, megnövekedett méret, csökkent bozótosság és megnövekedett termékenység (ábra. (Ábra.1).1). Ezek a közbenső fluoreszcens cmt3 izolátumok nem tértek vissza nem fluoreszcenciává, ami a maradék PAI2 metiláció elvesztésének diagnosztikája (Bender and Fink 1995), kimutatható gyakorisággal. Részlegesen megnövekedett hasítást mutattak a HpaII-val, az MSPI-vel pedig erősen megnövelték a Pai gének hasítását a szülői pai1C251Y-hez képest (ábra. (Ábra.2A).2A). A hasítási minta azt sugallta, hogy a cmt3 mutánsokat leginkább a PAI gének CNG-metilezésének fenntartása érinti. Annak meghatározására, hogy a cmt3 mutánsok is befolyásolták-e egy erősen ismétlődő genomiális szekvencia metilezését, a HpaII/MspI Déli blot-ot egy szondával a 180 bp centromer-asszociált ismétlés (CEN) szekvenciákra (Vongs et al. 1993). Ez a szonda kevés hatást mutatott a HpaII hasításra, de növelte az MspI hasítását, összhangban a PAI gének megfigyelt mintájával (ábra. (Ábra.2B).2B). A megnövekedett MspI hasadás hasonló mintázatát figyelték meg az ismételt rDNS-nél is (az adatok nem jelennek meg). Mind a 11 vizsgált cmt3 allél azonos metilezési mintázattal rendelkezett ezekben a vizsgálatokban. Sőt, amikor a cmt3 allélokat elkülönítették a pai1c251y alléltól egy vad típusú WS háttérbe, ezekben a vizsgálatokban azonos metilezési mintákat is mutattak (ábra. (Ábra.2).2). A Pai és CEN metilációs minták különböztek a jellemzett ddm1 és met1 metilációs hiányos mutációk által indukált mintáktól (ábra. (Ábra.2; 2; Bartee és Bender 2001).

a cmt3 mutáns háttér metilációs mintáinak pontosabb meghatározása érdekében metilációs minták genomi szekvenálását hajtottuk végre egy reprezentatív cmt3 allél PAI1 és PAI2 promoter régióiban nátrium-biszulfit mutagenezis alkalmazásával (Frommer et al. 1992). Ez az elemzés kimutatta, hogy a metilezett citozinok többsége (87% a PAI1-ben és 70% a PAI2-ben) a CG-maradékoknál fordult elő (ábra. (Ábra.3; 3; Táblázat Táblázat1).1). Összehasonlítva a vad típusú WS PAI1 promóterrel (Luff et al. 1999; táblázat Táblázat1),1), A CG metiláció 34% – kal csökkent, a CNG metiláció megszűnt, az aszimmetrikus metiláció 93%-kal csökkent; a PAI2 promoter esetében a CG metiláció 8% – kal, a CNG metiláció 92% – kal, a nem CG metiláció pedig 75% – kal csökkent. Így a CMT3 funkció elvesztése erős hatással van a CNG fenntartására és az aszimmetrikus metilációra, és gyengébb hatással van a CG metiláció fenntartására. Ezek az eredmények összhangban vannak azokkal a jelentésekkel, amelyek szerint az Arabidopsis CMT3 és a kukorica ZMET2 fontosak a CNG metiláció fenntartásához a különböző genomiális helyeken (Lindroth et al. 2001; Papa et al. 2001), de tovább mutatják, hogy a CMT3 szintén fontos a Pai gének aszimmetrikus metilezésének fenntartásához. Ez az eredmény vagy azt jelenti, hogy a CMT3 közvetlenül szabályozza mind a szimmetrikus, mind az aszimmetrikus metilációt, vagy hogy a szimmetrikus metiláció csökkenése a cmt3 mutáns háttérben másodlagos következményként csökkent aszimmetrikus metilációt okoz. Mivel a PAI2 reporter gén promóter és első exonjában (370 BP) lévő metilezett szekvenciák csak 16 diszpergált CG-motívumot tartalmaznak, a nem CG-metiláció elvesztése jelentősen hipometilálja a gén ezen régióját (ábra. (Ábra.3), 3), a szuppresszor mutáns fokozott PAI2 expressziójának elszámolása.

a pai1c251y cmt3 szuppresszor izolátumok cmt3 mutáns lokuszát keresztezéssel térképeztük fel az ND-0 polimorf törzzsel, amelynek hasonló elrendezése van a sűrűn metilezett PAI géneknek, mint a WS-ben (Melquist et al. 1999). A pai1c251y és a cmt3 homozigozitását diagnosztizáló gyengén fluoreszcens fenotípusú F2 utódokat UV-fény alatt végzett szemrevételezéssel azonosították, és az MSPI Southern blot megerősítette az erős Pai hasadást, hasonlóan a szülői szuppresszor izolátumokban megfigyelthez. Az F2 növények feltérképező populációját, amely megfelelt ezeknek a kritériumoknak, ezután felhasználták az elnyomott fenotípushoz kapcsolódó genomi lókuszok pontozására. A leképezési elemzés feltárta a kapcsolatot az 1. kromoszóma alsó karjának egyetlen lokuszával. Mivel a CMT3 feltételezett citozin-metil-transzferáz gén erre a lókuszra térképez, erre a génre összpontosítottunk jelöltként. Minden leképező populáción belül teljes kapcsolatot találtunk egy polimorf markerrel, amely a CMT3 gén 100 kb-án belül található. Annak igazolására, hogy a CMT3 gén valójában a metilációs szuppresszor mutációk helye volt, klónoztuk és szekvenáltuk a gént a 11 mutáns izolátumból. A szekvenálás egyetlen bázisváltozást tárt fel a CMT3 kódoló szekvenciában minden izolátumban. A mutáns allélek közül három teljesen konzervált aminosavat érintett a metiltranszferáz katalitikus doménjében, beleértve a biszulfit szekvenálásához használt reprezentatív cmt3G456D allélt. Az előrejelzések szerint egy másik allél idő előtt megszünteti a fehérjét. Két allél létre splice junction mutációk. A fennmaradó öt allél a metiltranszferáz motif IV és a fehérje C terminálisa közötti aminosavakat érintette, amelyek erősen konzerváltak a CMT gének között (ábra. (Ábra.4).4).

annak további megerősítésére, hogy a CMT3 gén volt a mutáns lokusz, átalakítottuk a PAI1C251Y cmt3 izolátumokat a cmt3 gén vad típusú ws genomi klónjával. A transzformáns palánták erősen fluoreszkáltak, hasonlóan a pai1C251Y törzséhez (ábra. (Ábra.1).1). A Southern blot analízissel vizsgált transzformáns vonalak a T2 generációban a PAI2 gén remetilációját mutatták az eredeti pai1C251Y törzsben megfigyelt szintre (az adatok nem láthatók). Így a klónozott CMT3 gén kiegészítheti a mutáns metilezési hibákat. Kontrollként a reprezentatív pai1C251Y cmt3G456D mutánst a cmt2 gén vad típusú ws genomi klónjával is átalakítottuk. CMT2 transzformáns palánták gyengén fluoreszkáló, hasonlóan a nem átalakult szülői törzs (ábra. (Ábra.1), 1), és nem mutatott kimutatható PAI2 remetilezést. Ez az elemzés azt mutatja, hogy a CMT2 nem helyettesítheti a CMT3 funkciót. Ebben a tekintetben érdekes megjegyezni, hogy a CMT2 elsősorban N-terminális szekvenciájában különbözik a CMT3-tól (ábra. (Ábra.44).

korábban jellemzett metilezés-hiányos Arabidopsis törzsek, amelyek hibái az SWI2/SNF2 kromatin-átalakítási faktorral kapcsolatos gén DDM1 (Jeddeloh et al. 1999) vagy a Dnmt1-hez kapcsolódó MET1 citozin-metil-transzferáz gén progresszív fejlődési rendellenességeket mutat (Finnegan et al. 1996; Kakutani et al. 1996; Ronemus et al. 1996). A hatgenerációs beltenyésztett pai1C251Y cmt3 és a kétgenerációs beltenyésztett cmt3 törzsek előzetes elemzése nem tárt fel nyilvánvaló elkülönülést a morfológiai változásokban. Ez a cmt3 és más metilációhiányos mutánsok közötti különbség valószínűleg tükrözi azt a tényt, hogy a CG metiláció nagyobb mértékben megmarad a cmt3-ban, mint a ddm1-ben vagy a met1-ben (ábra. (Ábra.2; 2; Bartee és Bender 2001). Mivel az Arabidopsis Genom számos endogén metilezett helye, például a CEN ismétlődik (ábra. (Ábra.2; 2; Vongs et al. 1993; Lindroth et al. 2001), valamint az FWA homeo-domén gén promótere (Soppe et al. 2000; Lindroth et al. 2001), elsősorban CG metilációt hordoz, a cmt3 mutációk várhatóan nem befolyásolják erősen ezeket a lókuszokat. Ehelyett a CMT3 valószínűleg megerősítő metilázként működik, amely extra metilációs réteget ad bizonyos genomi régiókhoz, például a PAI génekhez, amelyekben a megnövekedett metilációs sűrűség fokozott hangtompításhoz vezet. Egy speciális modell szerint a CG metiláció bazális rétege, amelyet más funkciók, például a MET1 biztosítanak, útmutatóként szolgálhat a CMT3 számára, amely ezután a bazális réteget extra CG-vel és nem CG-metilációval díszítené. A CMT3 célzott régiókba történő toborzása magában foglalhatja a kromatin fehérje kölcsönhatásait a kromodomain motívummal (Henikoff and Comai 1998), valamint az egyedi N-terminális szekvenciák által közvetített kölcsönhatásokat.

mivel az olyan gombák, mint a Neurospora crassa és az Ascobolus immersus fenntarthatják a nem CG metilációt (Selker et al. 1993; Goyon et al. 1994), ezek az organizmusok kódolhatják a CMT géneket. Ezzel szemben, mivel az állatok, mint például az emberek és az egerek nem rendelkeznek nem CG metilációval, ezeknek az organizmusoknak várhatóan hiányzik a CMT génje, amint az a jelenlegi szekvenciaadatbázisok elemzéseiből is kiderül. A CMT-szerű metilázok nyilvánvaló hiánya az állati genomokban (Finnegan and Kovac 2000) arra utal, hogy az állatok alternatív mechanizmusokat fejlesztettek ki a kromatinállapotok megerősítésére.