In-vitro-Bewertung von kolloidalem Silber auf die Immunfunktion: Antilymphoproliferative Aktivität

Zusammenfassung

Kolloidales Silber (AgC) wird derzeit vom Menschen verwendet und kann durch Inhalation, Injektion, Einnahme und Hautkontakt verinnerlicht werden. Es gibt jedoch nur begrenzte Informationen über die immunologische Aktivität; Weitere Untersuchungen mit kolloidalem Silber sind erforderlich. In der vorliegenden Studie wurden die Auswirkungen von AgC (17.5 ng / ml) auf immunologische Parameter (Proliferation und Immunphänotypisierung) unter Verwendung humaner peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMC) und Makrophagen (Phagozytose) und Zytotoxizität auf Leukämie- und Lymphomkrebszelllinien (1,75 bis 17,5 ng / ml) untersucht. Es wurde beobachtet, dass AgC die durch Phytohämagglutinin oder Concanavalin A induzierte Produktion und Proliferation von Interleukin-2 (IL-2) in PBMC signifikant () verringert, ohne die Zelllebensfähigkeit zu beeinträchtigen, jedoch mit zytotoxischer Wirkung auf Krebszellen. Die Produktion von IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, INF-γ und IL-17A−Zytokinen sowie die Phänotypen CD3+, CD3-CD19+, CD3+CD4+, CD3+CD8+ und CD16+CD56+ PBMC wurden von AgC nicht beeinflusst. Die vorliegende Studie zeigt, dass kolloidales Silber für die Zellen des Immunsystems harmlos und ungiftig ist und seine Fähigkeit, die Immunantwort durch Verringerung der Zellproliferation bei Stimulation mit Mitogenen zu stören, zeigte das antilymphoproliferative Potenzial von AgC.

1. Einleitung

Die Bioaktivität von Substanzen wurde untersucht, um Eigenschaften zu identifizieren, die mit der antitumoralen oder antiproliferativen Wirkung zusammenhängen . Produkte mit dieser Aktivität wurden in der klinischen Praxis zur Behandlung von Krebs oder entzündungsbedingten Krankheiten wie Autoimmunität eingesetzt. Silberprodukte werden seit Tausenden von Jahren zur Hygiene und als antimikrobielle Mittel verwendet. Seit 1964 ist kolloidales Silber (AgC) in den USA als Biozidmaterial registriert ; In Mexiko wird AgC häufig als Desinfektionsmittel für Wasser und Lebensmittel für den menschlichen Verzehr verwendet . Im Allgemeinen sind diese Produkte eine Mischung aus metallischen Nanopartikeln mit der Oxidationsstufe Null (Ag + 0) und Silbersalzen mit den Oxidationsstufen Ag + 1, + 2 oder + 3 . Es gibt Studien, die darauf hinweisen, dass die antibakteriellen und antitumoralen Eigenschaften von den Oxidationsstufen von Silber abhängen . Silbernanopartikel (AgNPs) und Silberionen (Ag +) haben aufgrund ihrer oberflächlichen Ladungswechselwirkungen unterschiedliche Toxizitätsgrade. Silberionen sind toxischer, weil sie mit negativen Gruppen von Proteinen interagieren können, was zu strukturellen Veränderungen an der Zellmembran und den zytoplasmatischen Proteinen führt, während AgNPs mit DNA interagieren und Schäden und strukturelle Blockierungen verursachen können; Einige Studien haben vorgeschlagen, dass diese Nanostrukturen bei langen Expositionszeiten eine erhöhte Toxizität hervorrufen können, da AgNPs in wässrigen Lösungen Silberionen oxidieren und freisetzen können; Der erfolgreiche Einsatz kolloidaler Silberlösungen kann durch diesen Aktionsmechanismus erklärt werden . Die Antikrebsaktivität von AgC auf MCF-7-Krebszellen ist wahrscheinlich auf eine induzierte Apoptose durch Verringerung der Lactatdehydrogenase und Erhöhung der Superoxiddismutaseaktivitäten zurückzuführen; Im Gegensatz dazu nahm die Lactatdehydrogenaseaktivität in PBMC mit AgC ab, korrelierte jedoch nicht mit dem Zelltod . Es gibt kaum wissenschaftliche Informationen über immunologische und Krebsparameter beim Menschen in Bezug auf die Auswirkungen von kolloidalem Silber als Mischung aus Nanopartikeln und Ionen im Vergleich zur Silbernanopartikelforschung. Die vorliegende Studie wurde entwickelt, um die antiproliferativen Eigenschaften von kolloidalem Silber und seine Wirkung auf die zelluläre Immunphänotypisierung, Zytokinproduktion und Phagozytose auf PBMC zu untersuchen.

2. Materialien und Methoden

2.1. Kolloidales Silber (AgC)

Grenetin-stabilisiertes kolloidales Silber wurde von MICRODYN (México) als 0,35% ige Stammlösung bezogen. Es wurde durch Filtration (0,2 µm Filter, Millipore, USA) sterilisiert und auf eine Konzentration von 10,5 µg/ml mit RPMI-1640 verdünnt, ergänzt mit 10% FBS für in vitro Assays.

2.2. Reagenzien

Phytohämagglutinin (verwendet in Dosen von 5 µg / ml) und Concanavalin A (verwendet in Dosen von 5 µg / ml) wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. Doxorubicin (LEMERY S.A. de C.V., México) wurde als 3,4 mm Stammlösung in RPMI 1640 bei Raumtemperatur gelagert und LPS (E. coli 0111:B4, Sigma-Aldrich) bei 10 ng/ml zur Behandlung von mononukleären Zellen des menschlichen peripheren Blutes hergestellt.

2.3. AgC-Charakterisierung

Die Morphologie von kolloidalem Silber wurde mit dem Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop (SEM) (Nova NanoSEM200 FEI) untersucht. Kolloidale Lösung (50 µL) wurde auf ein Kohleband gelegt und bei Raumtemperatur getrocknet. Nanopartikelgröße und Verteilungsmessungen wurden unter Verwendung einer dynamischen Lichtstreuung (DLS) bestimmt, die von einem Nanosizer NS 90 Malvern Instruments (Malvern Instruments, UK) durchgeführt wurde; Die von DLS angegebenen Größenverteilungen wurden als Prozentsatz der Intensität angegeben, und die Ergebnisse wurden als Mittelwert von mindestens drei Messungen dargestellt. Mittels UV-vis gemessenes Resonanzplasmon wurde in einem Bereich zwischen 300 und 600 nm mit dem NanoDrop Spectrophotometer 2000 (Thermo Fisher Scientific) beobachtet.

2.4. Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC)

Blut von gesunden menschlichen Freiwilligen wurde mit heparinisierten Spritzen erhalten und in sterile Polypropylenröhrchen gegeben. PBMC wurden weiter mit histopaker 1.077 Dichtegradientenzentrifugation bei 400 g für 30 min bei 25°C isoliert (Sigma-Aldrich). PBMC wurden zweimal mit RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% antibiotisch-antimykotischer Lösung (bezeichnet als vollständiges RPMI Medium) bei 250 g für 10 min bei 25°C gewaschen.

2.5. Zellviabilität

PBMC wurden in vollständigem RPMI-Medium auf 1 × 106 Zellen / ml eingestellt und 17,5 ng / ml kolloidales Silber zugegeben und 72 h bei 37 ° C und 5% CO2-Atmosphäre inkubiert. Danach wurde der Überstand bei 250 g abzentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit vollständigem RPMI-Medium gewaschen. Die Zelllebensfähigkeit wurde durch den kolorimetrischen MTT-Reduktionstest bestimmt, und die optischen Dichten, die sich aus der Formazanproduktion ergeben, wurden bei 570 nm abgelesen. Die Zellviabilität wurde im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle als prozentuale Viabilität ausgedrückt. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Experimenten angegeben.

K562 (chronische myeloische Leukämie), MOLT-4 (akute lymphoblastische Leukämie), Ramos (Burkitt-Lymphom) und L5178Y (Lymphom) Krebszelllinien wurden aus der American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) gekauft und in vollständigem RPMI-Medium gehalten. Die Zellen wurden bei 37 ° C und 5% CO2-Atmosphäre gezüchtet. Krebszelllinien (5 × 103 Zellen/Well) wurden auf 96-Well-Platten plattiert und 24 h bei 37°C in 5% CO2-Atmosphäre inkubiert.

Nach der Inkubation wurde das Kulturmedium entfernt und kolloidales Silber in Konzentrationen von 1,75 bis 17,5 ng/ml zugegeben. Anschließend wurden die Platten 5 h bei 37°C und 5% CO2-Atmosphäre inkubiert. Danach wurde der Überstand entfernt und die Zellen zweimal mit RPMI 1640 Medium gewaschen. Die Zelllebensfähigkeit wurde durch die Trypanblau-Ausschlussmethode bestimmt, und die Zytotoxizität wurde als 50% (LD50) und 100% (LD100) Zellwachstumshemmung im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle ausgedrückt. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Experimenten angegeben.

2.6. Zytokin-Assay

Überstände aus AgC-behandeltem PBMC wurden auf Zytokinspiegel analysiert. IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-γ, TNF-α und IL-17A humane Zytokine wurden durchflusszytometrisch (Accuri C6, BD Bioscience, CA, USA) unter Verwendung des CBA Th1/ Th2/Th17 Cytokine Kit BD™ (BD Bioscience, Bedford, MA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Die CBA Flex Set-Analyse wurde mit der FCAP array v1.0-Software (Soft Flow Inc., USA). Proteinwerte wurden für weitere Vergleiche in NIBSC / WHO-Proteinstandards umgerechnet.

2.7. Proliferations- und IL-2-Assay

PBMC wurden durch histopake Dichtegradientenzentrifugation isoliert, dreimal mit PBS gewaschen und in Verdünnungsmittel C bei 106 Zellen / ml resuspendiert. Die Zellsuspension wurde dann mit dem gleichen Volumen von 2,5 mM PKH26-Farbstoffvorrat (Sigma, St. Louis, MO) verdünnt, das in Verdünnungsmittel C hergestellt wurde, 3 min bei Raumtemperatur inkubiert, dann zu einem gleichen Volumen FBS gegeben und weitere 2 min bei Raumtemperatur inkubiert, um die Markierung zu stoppen, gemäß “Rimaniol et al., 2003 .” Danach wurden PBMC auf Konzentrationen von 1 × 106 Zellen/ml eingestellt, mit kolloidalem Silber in einer Konzentration von 17,5 ng / ml, PHA oder Con A behandelt und 72 h bei 37 ° C und 5% CO2 -Atmosphäre inkubiert; Die Zellproliferation wurde durchflusszytometrisch bestimmt. Die Mengen an IL-2-Gehalt in Überständen von PBMC wurden mit dem Human IL-2 High Sensitivity ELISA Kit (Nachweisgrenze 0,4 pg/ml) gemessen und nach Angaben des Herstellers (eBiosciences, Wien, Österreich) verwendet.

2.8. Bestimmung der Nitrit/Nitrat-Produktion

Die Nitrit- und Nitratgehalte wurden durch die kolorimetrische Griess-Reaktion unter Verwendung von Nitratreduktase (Nitrat / Nitrit Colorimetric Assay Kit Cayman, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Die Serumnitrit-/Nitratwerte wurden als nM/200 µL ausgedrückt.

2.9. Durchflusszytometrische Analyse von Zelloberflächenantigenen

PBMC wurden bei Konzentrationen von 1 × 106 Zellen / ml eingestellt und mit kolloidalem Silber in der Konzentration von 17,5 ng / ml behandelt, und die Platten wurden für 72 h bei 37 ° C und 5% CO2 inkubiert Atmosphäre. Danach wurden Zellen durch Zentrifugation bei 600 g für 10 Minuten gesammelt und ein Satz Antikörper CD3+ FITC/CD8+, PE/CD45+ und PerCP/CD4 APC oder ein anderer Satz Antikörper CD3+ FITC/CD16+, CD56 PE/CD45 und PerCP/CD19 APC (BD Multitest IMK Kit) zugegeben und 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden die Erythrozyten durch Zugabe von 450 µL 1x BD FACS™ Lyselösung lysiert und 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die Proben waren dann bereit, auf dem Zytometer analysiert zu werden. Die Erfassung wurde am Accuri C6 BD-Gerät unter Verwendung der BD Multiset-Software mit der BD Worklist Manager-Software durchgeführt. Automatisiertes Gating wurde zur einfachen Analyse jeder Teilpopulation verwendet.

2.10. FITC-Dextran-Aufnahme

Dendritische Zellen (DCs) wurden aus PBMC erzeugt und an 0,22 µm Filterkappen-Kulturflaschen (TPP, Deutschland) anhaften gelassen. Nach 2 h bei 37°C wurden nonadherente Zellen entfernt und anschließend adhärente Monozyten für 5 Tage in RPMI-1640, supplementiert mit 10% FBS und 800 U/ml rhuGM-CSF (Peprotech, México) und 50 ng/ml IL-4 (Peprotech, México) kultiviert. Danach wurden die Zellen mit kolloidalem Silber in Konzentrationen von 17,5 ng/ml behandelt und 72 h bei 37°C und 5% CO2-Atmosphäre inkubiert. Die DCs-Endozytose wurde bewertet, indem 1 × 106 Zellen mit 1 mg / ml FITC-Dextran (BD) für 30 min bei 37 °C inkubiert wurden. Zu den Kontrollen gehörten Röhrchen, die mit FITC-Dextran bei 4 ° C inkubiert wurden, um den endozytären Prozess zu hemmen, und eine basale Aufnahme, die zum 0-Zeitpunkt durchgeführt wurde. Die Aufnahme wurde durch FACS-Analyse (10.000 Zellen pro Punkt) quantifiziert . Die Lebensfähigkeit wurde durch die Trypanblau-Ausschlusstechnik bestimmt.

2.11. Statistische Analyse

Die Ergebnisse wurden durch ANOVA ausgewertet und die mittleren Zytokinspiegel zwischen den Behandlungen wurden unter Verwendung des Mann–Whitney-Tests verglichen.

3. Ergebnisse

3.1. Kolloidale Silbercharakterisierung

Die Charakterisierung von in Wasser und Zellkulturmedium gelöstem kolloidalem Silber wurde durch dynamische Lichtstreuung (DLS) analysiert; in Wasser gelöstes kolloidales Silber zeigte eine durchschnittliche Größe von 100 nm mit einem Polydispersitätsindex von 0,2; In Zellkulturmedium gelöstes kolloidales Silber zeigte eine durchschnittliche Größe von 155 nm und einen Polydispersitätsindex von 0,23 (Abbildungen 1 (a) und 1 (b)). REM-Bild zeigte Partikel in Wasser gelöst mit einer Partikelgröße zwischen 50 und 190 nm (Abbildungen 1 (c) und 1(d)); in Zellkulturmedium gelöstes kolloidales Silber zeigte eine Kombination von Nanopartikeln und einigen Silbersalzen (Abbildungen 1 (e) und 1 (f)); Die durch DLS erhaltene durchschnittliche Größe korrelierte jedoch mit dem Histogramm der Partikel und der charakteristischen Plasmonenresonanz (Abbildungen 1 (g), 1 (h) und 1 (i)). Die Analyse von kolloidalem Silber legt nahe, dass diese Lösung eine halbkugelförmige Form und eine heterogene Population aufweist, die von Nanopartikeln und Clustern gebildet wird, die von Silbersalzen gebildet werden. Nachdem die AgC charakterisiert war, bewerteten wir die verschiedenen biologischen Wirkungen.

Abbildung 1

Größenverteilung von kolloidalem Silber. (a) DLS von in Wasser gelöstem kolloidalem Silber zeigten eine durchschnittliche Größe von 100 nm mit einem Polydispersitätsindex von 0,2. (b) DLS-Messungen von in Zellkulturmedium gelöstem kolloidalem Silber mit einer durchschnittlichen Größe von 155 nm und einem Polydispersitätsindex von 0,23. (c, d) REM-Bild von in Wasser gelösten Partikelpopulationen. (e, f) REM-Aufnahme von in Zellkulturmedium gelöstem kolloidalem Silber. (g, h) Histogramm der in Wasser bzw. Kulturmedium gelösten Partikel. (i) UV-vis-Spektren von kolloidalem Silber. (j) Silbersalze, die in Proben von in Kulturmedium gelöstem kolloidalem Silber gebildet werden. DLS, dynamische Lichtstreuung; REM, Rasterelektronenmikroskopie; und u.a. beliebige Einheiten.

3.2. Bestimmung der Zellproliferation und IL-2-Produktion

Zunächst wurde festgestellt, ob die zuvor in Brustkrebszellen verwendete zytotoxische Dosis die Funktionen von Lymphozyten oder Makrophagen beeinflusst. Die Ergebnisse zeigten, dass die Behandlung mit kolloidalem Silber die Zellproliferation und Zellzahl von PBMC nicht signifikant beeinflusste () und die Behandlungen mit Mitogenen Con A oder PHA die Zellproliferation und Zellzahl im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle signifikant erhöhten (); Interessanterweise verringerten die kombinierten Behandlungen mit AgC / Con A oder AgC / PHA signifikant () die Zellproliferation und Zellzahl (Abbildungen 2 und 3) von PBMC. Ähnliche Ergebnisse wurden durch Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffs PKH26 (Kontrolle (94%), Con A (165%), PHA (156%), AgC (91%), AgC + Con A (80%) und AgC + PHA (77%)) beobachtet (Abbildungen 3, 4 und 5). Darüber hinaus beeinflusste die AgC-Behandlung die IL-2-Produktion im Vergleich zur Kontrolle (15 pg / ml) nicht (), aber eine Zunahme der IL-2-Produktion wurde festgestellt, wenn PBMC mit PHA (176 pg / ml) oder Con A (150 pg / ml) stimuliert wurden, und Behandlungen mit AgC + Con A (15 pg / ml) oder AgC + PHA (13 pg / ml) verringerten die IL-2-Produktion () (Abbildung 4).

Abbildung 2

Zelllebensfähigkeit von PBMC behandelt mit kolloidalem Silber und Mitogenen. PBMC (1 × 106 Zellen/ml) wurden mit Con A (5 µg/ml), PHA (5 µg/ml), AgC (17,5 ng/ml), AgC (17,5 ng/ml) + Con A (5 µg/ml) oder AgC (17,5 ng/ml) + PHA (5 µg/ml) behandelt und 72 h bei 37 °C und 5% CO2-Atmosphäre inkubiert. Die Zelllebensfähigkeit wurde mittels MTT-Assay analysiert. Die Daten stellen die mittlere ± Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten dar. . AgC, kolloidales Silber; PHA, Phytohämagglutinin; und Con A, Concanavalin A.

Abbildung 3

Zellzahl von PBMC, behandelt mit kolloidalem Silber und Mitogenen. PBMC (1 × 106 Zellen/ml) wurden mit Con A (5 µg/ml), PHA (5 µg/ml), AgC (17,5 ng/ml), AgC (17,5 ng/ml) + Con A (5 µg/ml) oder AgC (17,5 ng/ml) + PHA (5 µg/ml) behandelt und 72 h bei 37 °C und 5% CO2-Atmosphäre inkubiert. Die Zellzahl wurde durchflusszytometrisch analysiert. Die Daten stellen die mittlere ± Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten dar. . AgC, kolloidales Silber; PHA, Phytohämagglutinin; und Con A, concanavalin A.

Abbildung 4

Zellproliferation und IL-2-Produktion von PBMC, behandelt mit kolloidalem Silber und Mitogenen. PBMC (1 × 106 Zellen/ml) wurden mit Con A (5 µg/ml), PHA (5 µg/ml), AgC (17,5 ng/ml), AgC (17,5 ng/ml) + PHA (5 µg/ml) oder AgC (17,5 ng/ml) + Con A (5 µg/ml) behandelt und 72 h bei 37 °C und 5% CO2-Atmosphäre inkubiert. Die Zellproliferation basierend auf der Expression von PKH26 wurde durchflusszytometrisch analysiert. Die Auswertung der IL-2-Überstände erfolgte mittels ELISA-Test. Die Daten stellen die mittlere ± Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten dar. . AgC, kolloidales Silber; PHA, Phytohämagglutinin; und Con A, Concanavalin A.

(ein)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)

Abbildung 5

Zellproliferation von PBMC behandelt mit kolloidales Silber und Mitogene. PBMC (1 × 106 Zellen/ml) wurden mit (a) negativer Kontrolle, (b) Kontrolle, (c) PHA (5 µg/ml), (d) Con A (5 µg/ml), (e) AgC (17,5 ng/ml), (f) AgC (17,5 ng/ml) + PHA (5 µg/ml) oder (g) AgC (17,5 ng/ml) + Con A (5 µg/ml) behandelt und 72 h bei 37°C und 5% CO2 Atmosphäre. Die Zellproliferation wurde durch mikroskopische Fluoreszenz analysiert. AgC, kolloidales Silber; PHA, Phytohämagglutinin; und Con A, Concanavalin A.

3.3. Zytotoxische Wirkung von AgC auf lymphoide und Leukämiekrebszelllinien

Unsere Ergebnisse bestätigten die antiproliferativen und zytotoxischen Eigenschaften von AgC auf leukämische (Molt-4 und K562) und Lymphomzelllinien (Ramos und L5178Y) dosisabhängig (1,75 bis 17,5 ng / ml) () (Abbildung 6).

Abbildung 6

Zelllebensfähigkeit von Krebszelllinien, die mit kolloidalem Silber und Mitogenen behandelt wurden. K562-, Molt-4-, Ramos- und L5178Y-Krebszelllinien (5 × 103 Zellen / Well) wurden mit mehreren Dosen AgC behandelt und 5 h bei 37 ° C und 5% CO2-Atmosphäre inkubiert. Die Zelllebensfähigkeit wurde mittels MTT-Assay analysiert. Die Daten stellen die mittlere ± Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten dar. . AgC, kolloidales Silber.

3.4. Zytokinbestimmung

Neben der AgC-Behandlung hatte die Produktion () von IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-γ, IL-17A (0 pg / ml) oder TNF-α (5, 84 pg / ml) im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle keinen Einfluss. Die LPS-Behandlung als Positivkontrolle führte jedoch zu einer hohen Produktion aller untersuchten Zytokine (Tabelle 1).

3.5. Phänotypisierung von Zelloberflächenmarkern

Unsere Ergebnisse zeigten, dass die AgC-Behandlung den Prozentsatz der Expression der Zellpopulationen CD3+ (79,7%), CD3−CD19+ (10,2%), CD3+CD4 + (52,2%), CD3+CD8 + (33,9%) und CD16 + CD56 + (7,6%) im Vergleich zur Kontrollgruppe () nicht beeinflusste (Tabelle 2).

3.6. Bestimmung von Peroxynitriten und Aufnahme von FITC-Dextran

Die Behandlung mit kolloidalem Silber (99%) hatte keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit dendritischer Zellen (Abbildung 7(a)) oder die untersuchten Peroxynitritspiegel (Abbildung 7(b)), erhöhte jedoch den Phagozytose-Prozentsatz (Abbildung 7 (c)) im Vergleich zur Kontrolle ().

(ein)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Abbildung 7

Zelllebensfähigkeit menschlicher Makrophagen, Phagozytose und Peroxynitritenproduktion. Humane Makrophagen (1 ×106 Zellen) wurden mit AgC behandelt und 5 h bei 37°C und 5% CO2-Atmosphäre inkubiert. (a) Die Zelllebensfähigkeit wurde mittels Trypanblau-Assay analysiert. (b) Makrophagen Phagozytose von FITC-Dextran durch Durchflusszytometrie ausgewertet. (c) Nitrat/Nitrit bestimmt durch Griess-Reaktion (Nitrat/Nitrit-kolorimetrisches Assay-Kit); das LPS wurde als Positivkontrolle verwendet. Die Daten stellen die mittlere ± Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten dar. . AgC, kolloidales Silber; FITC-Dextran, Fluoresceinisothiocyanat-Dextran; und LPS, Lipopolysaccharid.

4. Diskussion

Es ist bekannt, dass mehrere in der Krebsbehandlung verwendete Chemotherapeutika (Cyclophosphamid, Vinblastin, Vincristin, Bleomycin und Cisplatin) antiproliferative und zytotoxische Wirkungen haben; aber bei niedrigen Dosen können sie die Immunantwort stimulieren . Die Wirkung einer Substanz auf das Immunsystem sollte getestet werden, da Schäden in diesem System die Homöostase des Körpers beeinträchtigen können. In der vorliegenden Studie deutet die Analyse von kolloidalem Silber auf das Vorhandensein einer heterogenen Population von Nanopartikeln und Clustern hin, die durch Silbersalze gebildet werden und wahrscheinlich aus Wechselwirkungen mit Proteinen stammen, die in einem Kulturmedium enthalten sind. Der Aggregationseffekt der Silberpartikel in biologischen Flüssigkeiten aufgrund der Anwesenheit von Proteinen und Lipiden wurde berichtet . Darüber hinaus zeigten unsere Ergebnisse, dass AgC (17,5 ng / ml) die durch Mitogene induzierte Produktion von IL-2 hemmen kann. Daher könnte die in PBMC induzierte Immunsuppression durch die Hemmung der IL-2-Freisetzung vermittelt werden. Die immunsuppressive Aktivität einiger Arzneimittel wie Cyclosporin und Azathioprin wurde durch die Hemmung der Proliferation von Lymphozyten und die Produktion von Zytokinen (INF-γ, IL-2, RANTES, TGF-β und TNF-α) bestätigt, wenn Lymphozyten durch Reagenzien wie PHA, Con A oder Pokeweed stimuliert werden Mitogen . IL-2 ist ein autokriner Wachstumsfaktor für T-Zellen und seine Produktion wurde durch die Behandlung mit den Immunsuppressiva Tacrolimus (FK506) oder Mycophenolsäure selektiv gehemmt . Es ist bekannt, dass Immunsuppressiva (Kortikosteroide) zur Behandlung lymphoider Malignome eingesetzt werden, da sie die Apoptose maligner lymphoider Zellen induzieren . Wir zeigten die antiproliferativen und zytotoxischen Eigenschaften von AgC (155 nm) (Dosen von 1,75 bis 17,5 ng / ml) auf leukämischen und lymphomatösen Zelllinien trotz früherer Berichte, in denen erwähnt wurde, dass Silberpartikel im Bereich von 10-100 nm Durchmesser zytotoxischer sind als größere Partikel . Es ist notwendig, den Mechanismus der Selektivität zwischen PBMC und Krebszellen myeloischen und lymphoiden Ursprungs zu kennen, und zukünftige Studien sollten im Bereich der rezeptorvermittelten Apoptose entwickelt werden, wie sie von “Vega und De Maio, 2005.” Aufgrund der Glukokortikoidresistenz bei der Lymphombehandlung setzen die Tumorzellen ihre Expansion in Gegenwart von Glukokortikoiden fort . Aus diesem Grund könnte AgC eine neue klinische Option bieten, die in Betracht gezogen werden muss, aber weitere Studien sind erforderlich. Auf der anderen Seite zeigen unsere Ergebnisse, dass die Zytokinproduktion und der Prozentsatz der von T-, B- und NK-Zellen exprimierten Oberflächenmarker als Reaktion auf AgC (17,5 ng / ml) im Gegensatz zu anderen Immunsuppressiva wie Rapamycin oder Soraphen nicht beeinflusst werden, für die der immunsuppressive Effekt auf die Störung eines Signalwegs und den Metabolismus von Fettsäuren zurückzuführen ist . Darüber hinaus gibt es Hinweise darauf, dass Zellen des Immunsystems als Reaktion auf Biomaterialien aktiviert werden können, obwohl MHC / Peptid / TCR-induzierte Signalwege nicht erwartet werden. Jedoch können alternative noncognate Bahnen zur Aktivierung führen, indem sie glycoproteins auf der Plasmamembranoberfläche wie mitogen induzierte Lymphozytenproliferation vernetzen. In Bezug auf Peroxynitrite induzierte kolloidales Silber (17,5 ng / ml) ihre Produktion nicht, aber die Phagozytoseaktivität stieg wahrscheinlich aufgrund der unspezifischen Aufnahme von kolloidalem Silber an. Andere Autoren haben beschrieben, dass Silber-Nanopartikel in einem Bereich von 5, 10, 15 und 100 nm die reaktiven Sauerstoffspezies erhöhen, die die Mitochondrienfunktion beeinflussen, und dass die Phagozytose von Silberpartikeln den Zellzyklus in der S-Phase blockiert und die Entzündungssignalisierung durch Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies stimuliert, gefolgt von der Sekretion von TNF-α, was die Lebensfähigkeit von Rattenleberzellen verringert.

Zusammenfassend zeigt die vorliegende Studie die Nichttoxizität von kolloidalem Silber gegenüber Zellen des Immunsystems und seine Fähigkeit, die Immunantwort zu stören, indem die Zellproliferation verringert wird, wenn sie mit Mitogenen stimuliert wird, was darauf hindeutet, dass kolloidales Silber als Immunsuppressivum angesehen werden kann.

Interessenkonflikte

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt bezüglich der Veröffentlichung dieser Arbeit besteht.

Danksagung

Diese Studie wird vom Labor für Immunologie und Virologie der Fakultät für Biowissenschaften der Autonomen Universität Nuevo Leon, San Nicolás de los Garza, NL, Mexiko, in Zusammenarbeit mit “Red Temática de Inmunología en Cáncer y Enfermedades Infecciosas” mit der Registernummer 253053, CONACYT.