Injizierbare humane rekombinante Kollagenmatrizen begrenzen den nachteiligen Umbau und verbessern die Herzfunktion nach Myokardinfarkt

Studiendesign

Hier führten wir eine Studie durch, um (i) klinisch relevante Kollagenhydrogele unter Verwendung von rekombinanten humanen Kollagenen Typ I und Typ III zu entwerfen; (ii) charakterisieren und vergleichen Sie die physikalischen Eigenschaften der Materialien rHCI und rHCIII; (iii) Bewertung des therapeutischen Potenzials der Materialien zur Behandlung von MI bei Mäusen; und (iv) Identifizierung von Mechanismen, die den beobachteten therapeutischen Wirkungen der rHC-Behandlung zugrunde liegen. Für In-vivo-Experimente wurde die LAD-Arterienligatur in Mäusen als klinisch relevantes und etabliertes Tiermodell von MI ausgewählt. Für funktionelle, histologische und molekulare Auswertungen wurde die Anzahl der Tiere pro Gruppe auf drei bis fünfzehn Mäuse minimiert, wie in der obigen Abbildung angegeben. Mäuse wurden randomisiert Behandlungsgruppen zugeordnet und alle Analysen wurden verblindet durchgeführt.

Herstellung und Charakterisierung von rHC-Matrices

Eine 1% ige Kollagenlösung wurde hergestellt, indem 0,1 g lyophilisiertes Kollagen (rHCI und rHCIII, von Fibrogen) in 10 ml ultrareinem ddH2O gelöst wurden. Chondroitinsulfat (CS; Wako), N-Ethyl-N-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) wurden mit zur Herstellung einer Endmischung mit einem Massenverhältnis von 1:4:0,5:0,3 für Kollagen:CS:NHS:EDC. Die Materialien wurden auf Eis mit einem geschlossenen System hergestellt, das ein homogenes Mischen ohne Blasenbildung ermöglicht. Nach gründlichem Mischen wurde der pH-Wert auf 7 eingestellt.4 durch NaOH (1,0 N). Matrizen ohne CS wurden ähnlich hergestellt, jedoch mit PBS hinzugefügt, um das Volumen von CS zu kompensieren. Mit Alexa-Fluor®594-NHS markierte Matrices wurden durch Zugabe von 20 µL der Farbstoffstammlösung (1 mg/ml in DMSO) zu den Gelen vor Zugabe der NaOH (25 nmol Farbstoff pro Hydrogel) und anschließende 20 Mischschritte hergestellt.

Materialviskosität

Viskositätsmessungen wurden mit einem Brookfield R/S plus Rheometer (Brookfield) bei 37 °C durchgeführt. Eine konische Spindel C25–2/30 wurde verwendet, um das Material (50 µm Verschiebung) auf einen temperaturgeregelten Sockel zu komprimieren. Die Viskosität wurde mit einem Rampendrehblock bei einer Geschwindigkeit von 1/min gemessen, voreingestellt bei einer Scherrate von fünf Einheiten über eine Zeit von 30 min.

Vernetzungsgrad

Zur Beurteilung des Vernetzungsgrades wurden Differential Scanning Calorimetry (DSC) Experimente durchgeführt. Kurz gesagt, Messungen wurden in einem Q2000 Differential Scanning Calorimeter (TA Instruments) im Bereich von 8 bis 80 ° C mit einer Scanrate von 5 ° C min−1 durchgeführt. Kollagenmatrizen (5-20 mg) wurden mit Filterpapier oberflächengetrocknet und mit einem Aluminiumdeckel (Tzero) hermetisch verschlossen; TA Instruments) in einer Aluminiumprobenpfanne (Tzero; TA Instruments). Die Denaturierungstemperatur (Td) wurde zu Beginn des endothermen Peaks gemessen.

Wassergehalt

Der Wassergehalt der Materialien wurde gemessen, indem das Nassgewicht (W0) der Probe gewogen und 96 h bei 4 °C in PBS äquilibriert wurde. Anschließend wurde das Material 96 h bei Raumtemperatur vakuumgetrocknet, um die Trockenmasse (W) zu erhalten. Der Gesamtwassergehalt der Hydrogele (Wt) wurde dann berechnet nach der Gleichung:

Abbau

Der enzymatische Abbau wurde unter Verwendung von 50-100 mg Hydrogel in 5 ml Kollagenase Typ I (10 U/ml in PBS) bei 37 °C gemessen. Die verbleibende Feststoffmasse wurde über einen Zeitraum von bis zu 24 h gemessen.

Materialporosität

Messungen der Tieftemperatur-Rasterelektronenmikroskopie (Kryo-REM) wurden bei -50 ° C mit einem Tescan (Modell: Vega II – XMU) durchgeführt, der mit einem kaltstufigen Probenhalter, einem Rückstreuelektronendetektor (BSE) und einem Sekundärelektronendetektor (SE) ausgestattet war. Porengrößen wurden aus mindestens 250 einzelnen 4 bis 6 zufälligen Bereichen der Probe mit der ImageJ®-Software gemessen. Durchmesser für Poren wurden unter Verwendung der Längsachse der Pore unter Verwendung des Geradlinienwerkzeugs quantifiziert. Der Bereich des Bildes wurde an die Größenskala angepasst, die vom Tescan Vega II system65 erhalten wurde.

Tierversuche

Alle Verfahren wurden vom Animal Care Committee der Universität Ottawa genehmigt und gemäß dem Leitfaden des National Institute of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt.

MI-Modell

MI wurde in 9 Wochen alten weiblichen C57BL / 6-Mäusen induziert (Charles River; Anzahl der Mäuse / Gruppe sind in der Abbildung unten) und die Behandlungsabgabe wurde unter Verwendung eines etablierten Protokolls durchgeführt26,27. Mäuse wurden anästhesiert (2% Isofluran), intubiert und das Herz wurde über eine vierte Interkostal-Thorakotomie exponiert. Die linke vordere absteigende Koronararterie (LAD) wurde dann knapp unterhalb ihres Austritts aus dem linken Vorhof ligiert. Dieses Verfahren führt zu einem großen MI, an dem die anterolateralen, posterioren und apikalen Teile des Herzens beteiligt sind, was zum Zeitpunkt der Operation durch Myokardblanchieren in der von der Arterie versorgten Region bestätigt wurde. Kurzwirksames Buprenorphin wurde mindestens eine Stunde vor der Operation verabreicht, und langwirksames Buprenorphin wurde unmittelbar vor der Operation zur perioperativen Analgesie subkutan verabreicht. Bei 1 Woche post-MI (baseline), Mäuse wurden zufällig zugewiesen, um die Behandlung von PBS (Kontrolle), rHCI oder rHCIII Matrizen, geliefert in fünf equivalumetric intramyokardialen Injektionen (10 µl jede Stelle, 50 µl insgesamt) durch eine 27-G-Nadel mit einem Ultraschall-geführten geschlossenen Brust-Verfahren. Die Spritze wird in einem Mikromanipulator (VisualSonics) befestigt, und vor dem Injektionsvorgang werden sowohl die Nadel als auch die RMV-Scankopfsonde entlang der Herzlängsachse ausgerichtet. Über das Ultraschall-Sichtfeld wird der Mikromanipulator verwendet, um die Nadelspitze an der gewünschten Stelle innerhalb des Myokards für die Abgabe der Injektionen zu positionieren (siehe ergänzende Fig. 1 und ergänzendes Video 1). Mäuse wurden 2 Tage oder 4 Wochen nach der Behandlung durch terminale Anästhesie getötet und Herzen wurden für die Histologie und / oder Messungen der mechanischen Eigenschaften gesammelt.

Echokardiographie

Die transthorakale Echokardiographie wurde an langachsigen Ansichten unter Verwendung eines Vevo770-Systems im B-Modus mit einer Echtzeit-Mikrovisualisierungs-Scankopfsonde der Serie 707B (VisualSonics) durchgeführt. Die Bildgebung wurde zu Studienbeginn vor der Behandlung durchgeführt Injektion (7 Tage nach MI) und 28 Tage nach der Injektion zur Bestimmung der linksventrikulären Ejektionsfraktion (LVEF), Fractional Area Change (FAC), endsystolisches Volumen (ESV), enddiastolisches Volumen (EDV), Schlagvolumen und Herzzeitvolumen. Beachten Sie, dass LVEF, ESV und EDV als klinische Prädiktoren für HF und Überleben nach MI44 verwendet werden.

Ex vivo Imaging der Alexa-Fluor®594-markierten Matrix

Die chemisch markierten rHC-Matrices (25 nmol Farbstoff pro Hydrogel) wurden wie oben beschrieben in das infarzierte Mausherz injiziert. Die Tiere wurden 2 h, 2 Tage und 7 Tage nach der Behandlung getötet, und die Herzen wurden geerntet und ex vivo mit dem IVIS®-Spektrum (PerkinElmer) abgebildet, um die rHCI- und rHCIII-Verteilung innerhalb der Herzen sichtbar zu machen (λ-Anregung: 570 nm; λ-Emission: 640 nm). Für die Histologie wurden Gewebeschnitte in Aceton präpariert und dann mit DAPI angefärbt, gefolgt von einer Bildgebung mit einem Leica Aperio Versa-Diascanner mit einer Endvergrößerung von × 20 und einem Z-Stack mit acht Schritten bei 1,5 µm.

Dehnungsanalyse

Die transthorakale Echokardiographie wurde an langachsigen Ansichten unter Verwendung eines Vevo3100-Systems im B-Modus mit einer Echtzeit-Mikrovisualisierungs-Scankopfsonde der MX400-Serie (VisualSonics) durchgeführt. Die Bildgebung wurde zu Studienbeginn vor der Behandlung durchgeführt Injektion (7 Tage nach MI) und 2 Tage nach der Injektion zur Bestimmung der endokardialen Längsdehnung zum Zeitpunkt des Aortenklappenverschlusses (Darstellung der Endsystole). Die Belastung in Segment 5 (dem vorderen Mittelsegment), die dem für die Behandlungsspritze bestimmten Grenzzonenbereich entspricht, wurde unter Verwendung der Vevostrain-Anwendung der Vevo LAB 3.1.1-Software (VisualSonics) 41 analysiert. Repräsentative Beispiele für die durchgeführten Messungen sind in der ergänzenden Fig. 10 für alle Versuchsgruppen plus ein gesundes (nicht infiziertes) Tier.

Elektrokardiographie

Elektrokardiogramme wurden gleichzeitig mit der Echokardiographie unter Verwendung eines Vevo3100-Systems (VisualSonics) zu Studienbeginn vor der Behandlung erhalten Injektion (7 Tage nach MI) und 2 Tage nach der Injektion. Elektrokardiogramme wurden aus Vevo LAB 3.1.1 exportiert. software (VisualSonics). Die Länge der PR-, QT- und QRS-Intervalle wurde mit der ImageJ-Software bestimmt (ergänzende Tabelle 1).

Mechanische Eigenschaften des Myokards

Mäuse wurden 2 oder 28 Tage nach der Behandlung durch terminale Anästhesie eingeschläfert und die Herzen wurden geerntet. Rechteckige Stücke (2,5 × 5 mm) des linken Ventrikels, die die Narbe und die Randzone umfassten, wurden herausgeschnitten. Zur Bestimmung der Zugelastizität des Gewebes (Elastizitätsmodul) wurden die Proben in einem mechanischen Universaltester von Instron (Modell 3342, Instron) mit Software der Serie IX/S mit einer Traversengeschwindigkeit von 10 mm min−1 mechanisch geprüft.

Histologie / Immunhistochemie

Objektträger von Myokardgewebeschnitten wurden aus einer Teilmenge von Herzen hergestellt, die nicht für mechanische Eigenschaftsmessungen verwendet wurden. 28 Tage nach der Injektion wurden die Herzen geerntet, mit PBS perfundiert, in OCT eingebettet und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Schnitte von 10 µm wurden mit einem Kryostaten geschnitten. Zur Beurteilung der Narbengröße wurden Gewebeschnitte für 1 h in 4% PFA fixiert und mit Massons Trichrome-Verfahren (Sigma) gefärbt. Bilder, die mit einem Olympus BX50-Mikroskop unter Verwendung eines 2 × -Objektivs und acht Abschnitten pro Maus aufgenommen wurden, wurden verwendet, um die Wanddicke zu messen und die Narbengröße unter Verwendung der Mittellinien-Bogenmethode unter Verwendung der MIQuant-software66 zu bestimmen. Für die Immunhistochemie wurden Gewebeschnitte 20 min in Aceton fixiert, 10 min mit 0,1% Triton permeabilisiert und anschließend 1 h bei Raumtemperatur in 10% Serum blockiert. Primärantikörper wurden über Nacht bei 4°C in 10%igem Serum appliziert, anschließend wurden Objektträger gespült und 1 h bei Raumtemperatur mit Sekundärantikörpern behandelt, bevor sie mit fluoreszierendem Montagemedium (Dako) montiert wurden. Zum Nachweis von Blutgefäßen und Myofibroblasten werden PECAM-1 (auch bekannt als CD31; Santa Cruz 101454, 1:50) und α-SMA (Abcam 5694, 1:200) Antikörper wurden verwendet und mit AF594 Anti-Ratte (Life Technologies A11008, 1:500) bzw. AF488 Anti-Kaninchen (Life Technologies A11007, 1:500) nachgewiesen. M2-Makrophagen wurden mittels AF488-konjugiertem Anti-CD206-Antikörper (Biolegend 141710, 1:50) nachgewiesen. Für die kardiale Troponin-I-Färbung wurden Schnitte mit AF488-markiertem Weizenkeim-Agglutinin (ThermoFisher, W11261) für 1 h bei 37 ° C inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit Ziegenherz-Troponin-I-Primärantikörper (Abcam ab56357, 1:200) und nachgewiesen mit Esel-Anti-Ziegen-AF594-Sekundärantikörper (Life Technologies A-11058, 1:500). Schließlich wurden für die Connexin-43-Färbung Abschnitte mit Connexin 43 / GJA1 (Abcam ab11370, 1:400) und Cardiac Troponin I (Abcam ab188877, 1:200) Primärantikörpern inkubiert, gefolgt von einem Nachweis mit AF488 Anti-Kaninchen (Life Technologies A11007, 1:500) und Esel Anti-Ziege AF594 Sekundärantikörper (Life Technologies A-11058, 1:500). Fluoreszenzbilder wurden mit einem Zeiss Axio Observer Mikroskop mit einem ×20 Objektiv erhalten und für die connexin 43 gefärbten Schnitte wurde ein Leica Aperio Versa Slide Scanner mit einem 20× Objektiv verwendet. Für alle IHC-Färbungen wurden vier Abschnitte pro Maus analysiert und für jeden Abschnitt wurden 2-4 Bilder innerhalb der Grenzzone, des Infarkts und der entfernten Regionen zur Analyse verwendet. Für die H&E-Färbung wurden Gewebeschnitte in 10% Formalin fixiert. 2 für 7 min, gefolgt von Säurealkoholdifferenzierung, und dann 0,5% Eosin für 7 min, gefolgt von Dehydratisierung (alle Lösungen von Sigma). Die Bilder wurden mit einem Olympus BX50 Mikroskop aufgenommen. Die Grenzzone wurde als FOV direkt neben beiden Seiten der Infarktregion bezeichnet, die beginnt, wenn 50% des LV fibrotisches Narbengewebe sind (siehe ergänzende Abb. 11 für eine schematische Darstellung).

Cx3cr1-EGFP-Mausexperimente

Um die Rekrutierung zirkulierender mononukleärer Zellen im Myokard nach rHC-Behandlung zu bewerten, wurden B6.129P-Cx3cr1 tm1Litt / J-Mäuse (Cx3cr1-EGFP) vom Jackson Laboratory gekauft. Diese Mäuse exprimieren ein verstärktes grün fluoreszierendes Protein in Monozyten, dendritischen Zellen, NK-Zellen und Gehirnmikroglia und sind ein Modell für die Studie der mononukleären Zellrekrutierung zum Herz67. 1 Woche nach MI erhielten Mäuse eine Behandlung mit 50 µl PBS, rHCI oder rHCIII, wie oben beschrieben. Die Tiere wurden 2 Tage nach der Behandlung getötet und Blut in EDTA-Röhrchen gesammelt. Außerdem wurden Herzen mit PBS perfundiert und der rechte Ventrikel und die apikale Region des linken Ventrikels wurden gesammelt. Die Gewebe wurden mit HBSS gespült und in 2 verdaut.4U/ml Dispase I (Roche) und 1 mg/ml Kollagenase B (Roche) für 40 min bei 37°C. Die Proben wurden dreimal mit PBS gewaschen, 5 min bei 400 g zentrifugiert und die isolierten Zellen für die Durchflusszytometrie vorbereitet (FACS Aria III; Becton Dickinson). Die Zellen wurden markiert mit APC anti-Maus/human CD11b (Biolegend 101211), PE Anti-Maus Ly-6G/6C (Biolegend 108407), PE/Cy5 Anti-Maus F4/80 (Biolegend 123111), PE/Cy7 Anti-Maus CD38 (Biolegend 102717) und Alexa Fluor® 700 Anti-Maus CD206 (Biolegend 141733) , nach den vom Hersteller empfohlenen Verdünnungen (0.25 µg/L pro 1 × 106 Zellen für CD11b, Ly-6G/6C, CD38 und CD206 und 1 µg/L pro 1 × 106 Zellen für F4/80). Siehe Ergänzende Abb. 12 für Sortier-/Gating-Strategie.

Zellisolierung und Durchflusszytometrie für Monozyten-Untergruppen

Zwei Tage nach der Behandlung wurden Mäuse durch CO2-Inhalation getötet, gefolgt von einer zervikalen Dislokation. Blut wurde von Mäusen durch Herzpunktion in einer 50 mM EDTA-Lösung entnommen und Erythrozyten wurden mit Erythrozyten-Lysepuffer gemäß dem Herstellerprotokoll (Biolegend 420301) lysiert. Zellen wurden aus geernteten Mausherzen unter Verwendung eines Verdauungspuffers isoliert, der enthielt: DNase I (50 U/µL; Sigma D5025), Kollagenase Typ II (400 U/ml; ThermoFisher 17101015), Kollagenase D (0,15 U/ml; Sigma 11088866001) und Hyaluronidase (10 U/ml; Sigma H3506). Nach einem einstündigen Aufschluss bei 37°C wurden isolierte Herzzellen durch einen 70 µm Filter geleitet. Schließlich wurden geerntete Mausmilzen püriert und durch einen 70 µm Filter verrieben, gefolgt von Inkubation mit Erythrozyten (RBC) -Lysepuffer. Zellpellets wurden durch Zentrifugation bei × 400g für 5 min bei 4 ° C gesammelt. Isolierte Zellen aus allen Geweben wurden mit einem Aqua fixierbaren Viabilitätsfarbstoff (1:500, Biolegend 423101) für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden Fc-Rezeptoren mit TruStain X-Reagenz (1:100, Biolegend 103319) für 10 min bei Raumtemperatur blockiert. Anschließend wurden die Zellen mit einem Antikörpercocktail für 45 min bei Raumtemperatur inkubiert, der CD45-APC/Fire 750 (1:160, Biolegend 30-F11), CD11b-PE/Cy7 (1:80, Biolegend M1/70), Ly6G-PerCP/Cy5.5 (1:160, Biolegend 1A8), CD3-PE (1:160, Biolegend 17A2), B220 -AF488 (1:50, Biolegend RA3-6B2), F480-AF647 (1:100, Biolegend BM8) und Ly6C-BV421 (1:80, BD Biosciences AL-21). Die Durchflusszytometrie wurde mit einem BD FACS Aria III durchgeführt und die Daten mit der FlowJo V10.5.2-Software analysiert (siehe ergänzende Abb. 12 für Sortier-/Gating-Strategie). Die Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen für jedes Gewebe nach der Isolierung wurde durch Trypanblauausschluss unter Verwendung eines Hämozytometers bestimmt. Die Gesamtzahl der Zellen innerhalb jeder Leukozytenpopulation wurde unter Verwendung des Prozentsatzes lebender Zellen für eine gegebene Zellpopulation bestimmt, und die Gesamtzahl der lebenden Zellen wurde nach der Isolierung gezählt, die dann auf mg Gewebe oder ml Blut normalisiert wurde. Gating-Strategie: Einzelzellen wurden basierend auf FSC-A und FSC-H mit einem Gatter versehen. Aus dieser lebenden Einzelzellpopulation waren Leukozyten CD45+. Leukozytenuntergruppen wurden wie folgt charakterisiert: neutrophile CD45+CD11b+Ly6G+, LY6C niedrige Monozyten CD45+CD11b+Ly6G−F480−Ly6C−, Ly6C hohe Monozyten CD45+CD11b+Ly6G−F480−Ly6C+, Makrophagen CD45+CD11b+Ly6G−F480+, T−Zellen CD45+CD11b−Ly6G−CD3+B220− und B−Zellen CD45 +CD11b−Ly6G-CD3-B220+. Hinweis für Blut Der F480-Ausdruck wurde in der Gating-Strategie nicht verwendet. Tore wurden relativ zu Isotypkontrollen gesetzt.

Neonatale Kardiomyozytenstudien

Neonatale ventrikuläre Rattenmyozyten (NRVM) wurden unter Verwendung eines etablierten Protokolls frisch isoliert68. Linke Ventrikel, die von 2 Tage alten Sprague-Dawley-Ratten (Harlan) gesammelt wurden, wurden durch Trypsin (Amersham Biosciences) und Kollagenase Typ II (Worthington Biochemical) verdaut. Isolierte Zellen wurden im M-199-Medium (Life Technologies) resuspensiert, ergänzt mit 10% FBS, 19,4 mM Glucose, 2 mM l-Glutamin, 2 U / ml Penicillin, 0,8 µg / ml Vitamin B12, 10 mM HEPES und 1 × MEM nichtessentielle Aminosäuren (Sigma-Aldrich). Zwei Runden von 60 min Vorplattierung wurden durchgeführt, währenddessen heften sich Herzfibroblasten an den Boden der Schale und bereichern so die nicht adhärente Population für NRVMs. Die nicht adhärenten Zellen (NRVMs) wurden dann auf die verschiedenen Kollagenmatrices in 24-Well-Platten (40.000 Zellen / cm2) ausgesät. Für den Überlebensassay wurden 3-tägige kultivierte NRVMs 3 h lang M-199-Medien mit 50 µM Wasserstoffperoxid unterzogen, wonach ein terminaler Desoxynukleotidyltransferase-dUTP-Nick-End-Markierungsassay (TUNEL) durchgeführt wurde und tote Zellen wurden in drei zufälligen Sichtfeldern gezählt.

Zellkulturen

Unter Verwendung eines etablierten Protokolls wurden aus dem Knochenmark stammende Makrophagen aus 8-12 Wochen altem C57BL / 6J-Mäuse69 isoliert. Mäuse wurden durch CO2-Inhalation und zervikale Dislokation eingeschläfert, und Tibiaknochen wurden gesammelt und mit Medien gespült, um das Knochenmark zu isolieren. Das Knochenmarkisolat wurde wiederholt pipettiert, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, die dann durch ein Zellsieb geleitet wurde. Frisch isolierte Zellen wurden 1 Woche lang in DMEM, ergänzt mit 10% FBS, 20% L929-konditionierten Medien und Penicillin–Streptomycin, kultiviert und dann 3 Tage lang auf den rHC-Hydrogelen erneut plattiert. Die Zellen wurden aus den rHC-Hydrogelen unter Verwendung von 3 mM CaCl2 Hank-Puffer-Salzlösung mit 250 Einheiten Kollagenase I (Gibco) gesammelt. Die Makrophagenpolarisation wurde mittels Durchflusszytometrie (FACS Aria III; Becton Dickinson) unter Verwendung von CD86 und CD206 (Biolegend) zur Identifizierung von M1- bzw. Zur mononukleären Zellisolierung wurde Knochenmark aus Tibiaknochen wie oben beschrieben gesammelt. Mononukleäre Zellen wurden durch Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung von Histopaque® (Sigma) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Die Zellen wurden mit 0 markiert.5 µg/ml DAPI (Sigma) für 30 min bei 37 °C.

Makrophagen-Adhäsionsassay

Mononukleäre Zellen wurden durch Spülen der Tibia und Femur von 6 bis 12 Wochen alten Mäusen isoliert. Die Zellen wurden durch Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung von Histopaque® (Sigma) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Mononukleäre Zellen wurden gezählt und mit DAPI markiert. Die Zellen wurden auf den verschiedenen Biomaterialien bei einer Konzentration von 50.000 Zellen/cm2 für 24 h plattiert. Die Zellen wurden mit 4% PFA für 5 min fixiert und die Zellen wurden gezählt. Die Daten wurden bezogen auf die Kontrolle (unbeschichtete Vertiefungen, d.h., TCPS), um den Effekt der Variabilität zwischen den Spenderzellen zu minimieren.

Makrophagenmigrationstest

Mononukleäre Knochenmarkzellen wurden in DMEM, ergänzt mit 10% FBS, 20% L929-konditioniertem Medium und Pen / Strep, 7 Tage lang kultiviert, um Knochenmark-abgeleitete Makrophagen (BMDMs) zu erzeugen und wie oben beschrieben mit DAPI markiert. BMDMs (2 × 105) wurden dann in EBM ohne Wachstumsfaktoren und Serum resuspendiert und in die obere Kammer einer Transwell-Platte (Life Technologies) geladen, die mit 100 µL rHCI oder rHCIII beschichtet war. Die untere Kammer enthielt volle Makrophagenmedien, wie oben beschrieben. Nach 24 h wurden die Inserts entfernt und die Anzahl der BMDMs, die durch das Biomaterial wanderten, verblindet mit einem Zeiss Z1 Fluoreszenzmikroskop quantifiziert. Die Daten wurden relativ zur Kontrolle (unbeschichtete Vertiefungen, d. H. TCPS) exprimiert, um den Effekt der Variabilität zwischen den Spenderzellen zu minimieren.

Makrophagen-Polarisations-Assay

BMDMs wurden in DMEM, ergänzt mit 10% FBS, 20% L929-konditioniertem Medium und Pen/Strep für 7 Tage, wie oben beschrieben, erzeugt. Für Makrophagenaktivierungsexperimente wurden Zellen 3 Tage lang mit Lipopolysaccharid (1 µg / ml; Sigma) plus IFN-γ (50 ng / ml; Sigma) zur M1-Aktivierung oder mit IL-4 (20 ng / ml; R & D Systeme) zur M2-Aktivierung stimuliert. Die Gesamt-RNA wurde mit Tri-Reagenz (Zymo Research) gemäß dem Herstellerprotokoll extrahiert. Die Erststrang-cDNA wurde mit Smartscribe Reverse Transkriptase (Takara Bio USA) und Random Hexamer Primern (Fisher Scientific) synthetisiert. Die Zielgen-mRNA-Spiegel wurden mittels quantitativer RT-PCR mit LightCycler 480 SYBR Green I Mastermix (Roche) und einem LightCycler 480 Real-Time PCR System (Roche) bestimmt. Sequenzen für Primerpaare sind in ergänzender Tabelle 2 aufgeführt. Relative Veränderungen der mRNA-Expression wurden durch die ∆∆Ct-Methode bestimmt, ausgedrückt als Spiegel relativ zu 18S. Die Daten wurden relativ zur Kontrolle (unbeschichtete Vertiefungen, d. H. TCPS) ausgedrückt, um den Effekt der Variabilität zwischen den Spenderzellen zu minimieren.

Überleben nach H2O2-Exposition

Die Zellen wurden 7 Tage lang in DMEM kultiviert, das mit 10% FBS, 20% L929-konditioniertem Medium und Pen / Strep ergänzt wurde. Am Tag 7 wurde das Medium auf DMEM umgestellt, das 0,5 mM Wasserstoffperoxid enthielt, und die Zellen wurden 3 h lang kultiviert, bevor sie mit 7-AAD zur durchflusszytometrischen Analyse angefärbt wurden. Die Daten wurden relativ zur Kontrolle (unbeschichtete Vertiefungen, d. H. TCPS) exprimiert, um den Effekt der Variabilität zwischen den Spenderzellen zu minimieren.

Statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde mit Kaleida Graph 4.5® durchgeführt. Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Für den Vergleich von In-vivo-Daten zwischen Behandlungen wurde eine ANOVA verwendet, gefolgt von einer Holm-Korrektur für Mehrfachvergleiche. Die Narbengröße wurde unter Verwendung einer multiplen Regression analysiert, einschließlich der Behandlungsgruppe (rHCI, rHCIII und PBS) und der LVEF zu Studienbeginn. rHCI und rHCIII im Vergleich zu PBS waren signifikante Prädiktoren für die Infarktgröße, zusätzlich zu Baseline LVEF. Der Korrelationskoeffizient für das Modell beträgt 0,6 unter Verwendung der multiplen linearen Regression von STATA. In-vitro-NRVM-, Makrophagen- und Herzfibroblastendaten wurden entweder durch einen Student-t-Test oder durch eine Einweg-ANOVA mit einer Holm-Korrektur für Mehrfachvergleiche analysiert, wie in der Abbildung unten angegeben.

Berichtszusammenfassung

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der Nature Research Reporting Summary, die mit diesem Artikel verknüpft ist.