(a) Il ciclo di vita sessuale di Chlamydomonas reinhardtii consiste… / Scarica Diagramma scientifico

… la natura delle sostanze genetiche che hanno sfidato la legge di Mendel. Studi approfonditi nel corso dell’ultimo secolo, utilizzando numerose tecniche, tra cui microscopia elettronica, genetica, biologia molecolare e biochimica, hanno rivelato che le sostanze genetiche sono in realtà genomi all’interno di cloroplasti e mitocondri (Kuroiwa 1991; Birky 1995). Si pensa che i cloroplasti (cp) e i mitocondri (mt) siano sorti da relazioni endosimbiotiche ancestrali tra cellule nucleate e batteri viventi liberi-cianobatteri e batteri alfa – viola, rispettivamente. Contengono i propri genomi, che sono presumibilmente vestigia dei loro progenitori (Gray 1992). Oggi, sappiamo che i geni cp e mt vengono trasmessi alla progenie esclusivamente dal genitore materno nei diversi taxa di piante superiori, felci, muschi, alghe (Kuroiwa 1991), funghi (Mitchell e Mitchell 1952; Kawano et al. 1987), e animali (Hutchison et al. 1974), compresi gli esseri umani. L’eredità uniparentale dei genomi cp/mt è stata a lungo considerata un risultato passivo basato sul fatto che le uova contengono più numeri di organelli, mentre i gameti maschili, nella migliore delle ipotesi, contribuiscono solo a pochi (Gyllensten et al. 1991). Tuttavia, è probabile che il processo di ereditarietà uniparentale sia più dinamico. Un esempio classico e eclatante sarebbe la presenza di ereditarietà non mendeliana nell’alga verde unicellulare, Chlamydomonas reinhardtii , che produce gameti di dimensioni identiche (isogamous) (Sager 1954). Il ciclo di vita di C.reinhardtii è squisitamente semplice. Esistono due tipi di accoppiamento di C. reinhardtii, tipo di accoppiamento più (mt+) e tipo di accoppiamento meno (mt ), controllati da un singolo loci di tipo di accoppiamento complesso sul gruppo di collegamento VI (Ferris et al. 2002). C. reinhardtii subisce un ciclo di vita sessuale, che include fasi definite di differenziazione (Figura 1). Le cellule vegetative si differenziano in gameti in condizioni di fame di azoto e irradiazione luminosa (Pan et al. 1996). In pochi minuti di essere mescolati, gameti di tipi di accoppiamento opposti aderiscono l’uno all’altro dai loro flagelli e si fondono per formare zigoti. Dopo un periodo obbligatorio di dormienza, lo zigote subisce meiosi e germinazione per produrre quattro progenie aploide. Più del 90% della progenie che si forma eredita i tratti del cloroplasto (cp), preferenzialmente dal genitore mt+, un fenomeno descritto per la prima volta più di 50 anni fa (Sager 1954). Sager ha descritto i modelli di ereditarietà di due mutazioni indotte dai raggi UV, sr1 e sr2 . La mutazione sr1 conferisce resistenza a bassi livelli di streptomicina antibiotica e la mutazione sr2 conferisce resistenza ad alti livelli di streptomicina. Quando sr1 è stato incrociato con un ceppo sensibile alla streptomicina, sono stati ereditati bassi livelli di resistenza alla streptomicina, seguendo la legge di Mendel. Al contrario, quando un genitore mt + portatore della mutazione sr2 è stato incrociato con un genitore mt sensibile, tutta la progenie meiotica era resistente ad alti livelli di streptomicina. Nella croce reciproca, la progenie meiotica era tutta sensibile alla streptomicina (Sager 1954). Nel 1962, le prove dell’esistenza del cpDNA provenivano dal lavoro al microscopio ottico ed elettronico di Ris e Plaut (Ris e Plaut 1962). Solo un anno dopo, Sager e Ishida descrissero l’isolamento del cpDNA mediante centrifugazione a gradiente di densità di cloruro di cesio (CsCl) (Sager e Ishida 1963). Nel 1989, la mutazione sr2 è stato dimostrato di localizzare all’interno del gene rps12 del genoma cp (Liu et al. 1989). In 1972, uno studio biochimico ha mostrato che la quantità di mt – cpDNA è diminuita rispetto a mt + cpDNA, 6-24 h dopo l’accoppiamento (Sager e Lane 1972). Il DNA di mt + e mt – gametes è stato etichettato con 14 N-o 15 NH 4 Cl e la centrifugazione a gradiente di densità CsCl è stata utilizzata per monitorare il destino del DNA nucleare e del cpDNA negli zigoti 6 e 24 – h. Sei ore nello sviluppo dello zigote, il segnale che rappresenta mt-cpDNA era chiaramente inferiore al mt + cpDNA, indicando una riduzione preferenziale di mt-cpDNA rispetto a mt + cpDNA. Nel 1980, la prima prova molecolare per la riduzione preferenziale di mt – cpDNA è stata fornita da Grant et al. (Grant et al. 1980). Gli autori hanno monitorato il comportamento di mt + e mt-cpDNA, sfruttando i polimorfismi di lunghezza del frammento di restrizione (RFLPs), in un ceppo mutante C. reinhardtii ac-u-g-23 che porta due piccole delezioni nel suo DNA di cloroplasto. Gli autori hanno scoperto che sia le eliminazioni in cpDNA che il fenotipo non fotosintetico erano ereditate uniparentalmente. Il genoma del cloroplasto di 203 kb di C. reinhardtii (Maul et al. 2002) è presente a ~ 80-100 copie per cellula, ed è organizzato in 5-10 complessi DNA-proteine, che sono chiamati nucleoidi cloroplasti (Kuroiwa et al. 1981). Nel 1982, Kuroiwa et al. trovato che DAPI (fluorocromo specifico dsDNA, 4′,6-diamidino-2-fenilindolo)-macchiato mt – cp nucleoidi scomparso preferenzialmente nei giovani zigoti entro 50 min di accoppiamento (Kuroiwa et al. 1982). Nel 1999, la scomparsa preferenziale dei nucleoidi mt – cp è stata osservata in uno zigote vivente, utilizzando SYBR Green I (fluorocromo specifico dsDNA che può permeare nelle cellule viventi) (Figura 1) (Nishimura et al. 1999). L’interpretazione di questo drammatico fenomeno, tuttavia, era controversa perché la scomparsa preferenziale dei nucleoidi fluorescenti mt – cp avveniva ben prima che la riduzione del DNA fosse rilevata con metodi biochimici o biologici molecolari (6-24 ore dopo l’accoppiamento) (Sager e Lane 1972). Due possibilità principali sono state proposte per spiegare questo. Una possibilità era che la disintegrazione dei nucleoidi cp potesse portare alla dispersione delle molecole di cpDNA, e la seconda possibilità era che la rapida digestione delle molecole di cpDNA potesse portare alla scomparsa dei nucleoidi cpDNA. Un problema nell’affrontare questa domanda è che la reazione di accoppiamento viene eseguita utilizzando milioni di mt + e mt – gameti (Figura 2). La popolazione cellulare è inevitabilmente una miscela eterogenea di cellule, come mt+ e mt – gameti non accoppiati, zigoti con o senza nucleoidi mt – cp e zigoti meitotici eccezionali (1~5%) che non formano zigoti meitotici (Ebersold 1967). Generalmente, i metodi molecolari e biochimici richiedono grandi quantità di campioni omogenei per analisi precise e qualsiasi eterogeneità nei campioni confonderebbe i risultati. In altre parole, le “personalità” delle singole cellule o organelli all’interno di una popolazione sarebbero diluite e molto probabilmente perse nel processo di analisi. D’altra parte, la microscopia può rivelare le “personalità” a livello morfologico, ma non a livello molecolare. Per studiare la condizione delle molecole di cpDNA durante la scomparsa dei nucleoidi mt – cp, è stato necessario raccogliere zigoti in base alla presenza o all’assenza di nucleoidi mt – cp e analizzare i singoli zigoti usando tecniche biologiche molecolari. Per raggiungere questo obiettivo, sono state impiegate pinzette ottiche (Figura 3). L’uso di pinzette ottiche è una nuova tecnica per manipolare cellule viventi o organelli sotto osservazione microscopica diretta (Ashkin et al. 1987). In questo studio, un singolo zigote con o senza nucleoidi cp è stato raccolto utilizzando pinzette ottiche e la presenza o l’assenza di molecole mt – cpDNA è stata determinata mediante analisi PCR nidificata. I destini individuali di mt + e mt – zigotico cpDNA sono stati seguiti separatamente utilizzando un trasformante cloroplasto LO3c, che ospita il gene batterico aadA (aminoglicoside adenil transferasi). I singoli zigoti ottenuti con le pinzette ottiche sono stati sottoposti ad analisi di PCR nidificata altamente sensibile per aadA (Figura 4) (Nishimura et al. 1999). Quando L03c mt + gameti sono stati incrociati con wild-type mt-gameti, sequenze di geni aadA sono stati rilevati in tutti gli zigoti che sono stati esaminati. Al contrario, quando i gameti mt L03c sono stati incrociati con gameti wild-type, le sequenze aadA sono state amplificate solo negli zigoti più giovani (10 e 30 min dopo la formazione dello zigote). Dopo la scomparsa dei nucleoidi fluorescenti mt – cp, le sequenze aadA non sono più state rilevate negli zigoti (90 e 120 minuti dopo la formazione dello zigote). Questi risultati indicano che le molecole mt-cpDNA sono completamente digerite in 10 min, durante il quale i nucleoidi mt – cp scompaiono, e anche che almeno una nucleasi altamente efficace viene attivata nel mt – cloroplasto subito dopo la formazione dello zigote. Questa digestione attiva di mt-cpDNA è probabilmente la base per eredità materna di cpDNA. Il modello più semplice per l’ereditarietà uniparentale di cpDNA è che il processo consiste di due eventi distinti che possono verificarsi in diverse fasi del ciclo di vita: una “protezione” di mt+ cpDNA, forse durante la gametogenesi, e un “distruttore” di mt – cpDNA non protetto durante lo sviluppo iniziale dello zigote. A) Ipotesi di restrizione –metilazione Nel 1972, Sager e colleghi hanno proposto che mt – cpDNA fosse digerito dall’azione degli enzimi di restrizione, mentre il mt+ cpDNA era protetto dalla metilazione – un modello analogo al sistema di restrizione-metilazione batterica (Sager e Lane 1972). Sager e colleghi hanno rapidamente accumulato prove convincenti che mostrano un aumento del livello di metilazione di mt + cpDNA, che è stato rilevato 7 h dopo l’accoppiamento (Burton et al. 1979; Royer e Sager 1979; Sano et al. 1980). Inoltre, è stata riportata la purificazione di mt+ DNA metiltransferasi gamete-specifiche, con pesi molecolari di 60 kDa e 20 kDa (Sano et al. 1981). Questo evento di metilazione specifico del gamete mt+ era apparentemente reversibile, come ci si aspetterebbe per la protezione (Sano et al. 1984). Il gene per la metiltransferasi del DNA residente nel cloroplasto è stato finalmente identificato nel 2002 e la sua espressione specifica del gamete mt+ e la localizzazione del cloroplasto sono state confermate (Nishiyama et al. 2002). D’altra parte, una serie di documenti di gruppi indipendenti ha successivamente sostenuto che la metilazione di mt+ cpDNA non poteva spiegare adeguatamente la protezione. Bolen et al. isolato un mutante nucleare me1 che metila costitutivamente cpDNA ad un livello superiore in entrambe le cellule mt+ e mt (Bolen et al. 1982). Quando i gameti me1 sono stati utilizzati per croci, sono stati osservati normali modelli di ereditarietà uniparentale, incoerente con il …