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Disclaimer: Solo per uso di ricerca. CETSA® è un marchio registrato di Pelago Bioscience AB. Si prega di notare che per l’uso del kit è richiesto un abbonamento CETSA® valido.

Il metodo CETSA® stesso

D : Che cos’è CETSA®?

A : Il saggio di spostamento termico cellulare è un metodo che consente la quantificazione dell’impegno bersaglio di un composto (TE) all’interno di cellule viventi o in cellule interrotte. Il principio del dosaggio CETSA® si basa sulla variazione del profilo di denaturazione termica della proteina bersaglio che si verifica in seguito al legame di un composto. Il test CETSA® viene eseguito incubando le cellule con il composto di prova, seguito dal riscaldamento delle cellule trattate con il composto e quindi misurando la proteina bersaglio solubile rimanente.

Q: Che cosa è spostamento termico

A: Al riscaldamento una proteina incontrerà una temperatura alla quale denatura (a volte indicato come il punto di fusione). Questa temperatura di fusione è una proprietà fisica e una costante per qualsiasi dato insieme di condizioni (pH, pressione, sali). I composti che interagiscono con una proteina cambieranno la temperatura di fusione (spostamento termico). Per un dato sito di legame all’interno di una proteina la dimensione della termica shift può essere misurata a diverse concentrazioni di composti (dose-risposta), e i valori di EC50 derivati da tali curve possono essere usati per stabilire un ordine di rango di potenza di una serie di composti, che correla direttamente l’ordine di rango di affinità dei composti . Ci sono diverse variazioni sul test di spostamento termico in vitro, ma la tecnica chiave è stata descritta per la prima volta da Semisotnov et al. (1991). In questo metodo, la proteina che si scioglie e si dispiega espone superfici idrofobiche che consentono a SYPRO orange di legarsi. La fluorescenza di questo colorante viene estinta in acqua, quindi il legame con queste superfici idrofobiche inverte questo e fa sì che la fluorescenza raggiunga il picco quando la proteina è completamente dispiegata. Questo tipo di saggio di spostamento termico può essere applicato solo a proteine altamente purificate e per le specie a bassa abbondanza questo può significare che è necessario un sistema di sovra espressione per generare quantità sufficienti.

Thermofluor – sistema di tintura sensibile alla temperatura (utilizzando Sypro Orange)

Fluorimetria a scansione differenziale (DSF) – metodi alternativi a base di coloranti

Sistemi PCR quantivi (ad esempio Roche Light cycler) : questi sono utilizzati per fornire l’evento di riscaldamento e in grado di misurare i cambiamenti di fluorescenza

Nanotemper – è una società di produzione strumento dedicato che riscalda il campione e misura la fluorescenza. Offre prestazioni migliori rispetto ai sistemi PCR adattati.

D: Perché è importante misurare l’impegno dell’obiettivo?

A: In assenza di conferma che un composto interagisce effettivamente con l’obiettivo desiderato, gli sviluppatori di farmaci possono perdere tempo prezioso e risorse che si muovono nella direzione sbagliata. Per questo motivo, la conferma dell’impegno target di un composto è stata a lungo considerata essenziale nella scoperta di farmaci. Tali saggi consentono confronti diretti dell’affinità di un composto per il suo obiettivo da effettuare, in quanto tale è una misura essenziale per selezionare quali composti avanzare in tutte le fasi della generazione e dell’ottimizzazione del piombo. Poiché l’impegno dell’obiettivo può essere correlato all’affinità, consente ai ricercatori di selezionare composti con i valori di affinità più elevati. Come tale è una misura estremamente utile per garantire la corretta priorità composto in ogni fase del processo di scoperta della droga.

D: In che modo CETSA® si differenzia dalle altre tecnologie di dosaggio a spostamento termico?

A: Oltre a CETSA ®, esistono numerosi metodi per valutare l’impegno Target (es. Risonanza plasmonica di superficie, polarizzazione di fluorescenza e Spostamento termico). Tuttavia, tutti questi metodi si basano sulla disponibilità di proteine purificate e possono essere applicati solo in vitro, il che significa che i valori di affinità derivati potrebbero non essere predittivi dell’affinità effettiva o del potenziale di legame nelle cellule viventi. Essere in grado di eseguire test di spostamento termico in un contesto cellulare rilevante, dove la proteina è nel suo ambiente nativo, in presenza delle sue proteine naturali partner, con concentrazioni fisiologiche dei suoi cofattori e substrati, produce dati molto più rilevanti, che si tradurranno meglio in modelli animali e studi clinici.

Mentre il Cellulare Termica Shift Assay è un metodo basato sullo stesso principio biofisico come standard Termica dosaggi di spostamento (cioè che specifica le proteine si denaturano ad una temperatura impostata) non misura direttamente la temperatura specifica di svolgimento, ma si basa invece sul fatto che la presenza di un composto sulla proteina influenzerà la quantità di proteine solubili presenti dopo il riscaldamento ad una temperatura impostata. Come tale, CETSA® è in sostanza un test proteico totale condotto dopo uno specifico evento di riscaldamento. I composti con differenti potenze di coinvolgimento target cambieranno le quantità relative di proteine sopravvissute all’evento di riscaldamento. Poiché il test misura questa proteina residua, piuttosto che un vero evento di fusione, può essere applicato a sistemi in vivo più complessi come cellule e lisati (e in alcuni formati CETSA® anche tessuti solidi). Inoltre, CETSA® può identificare i composti che destabilizzano una proteina (cioè riducono la sua temperatura di fusione), questo è meno semplice con gli altri metodi di spostamento termico.

Q: In che modo Alpha CETSA® si differenzia da altre tecnologie di analisi dello spostamento termico cellulare o da altri test di coinvolgimento cellulare?

A: Come accennato in precedenza, CETSA® è fondamentalmente un test proteico totale condotto dopo shock termico. Alpha CETSA ® utilizza un doppio sistema di rilevamento basato sulla prossimità anticorpale. Altri metodi evitano l’uso di un sistema basato anticorpo modificando la proteina bersaglio:

• Promega nanoluciferasi thermal shift assay (NaLTSA): Nanoluc Luciferasi fusa alla proteina bersaglio (proteina espressa in modo ricombinante); Quando il bersaglio proteico con il tag dell’enzima Nanoluc si aggrega, il segnale della luciferasi diminuirà.
• Promega NanoBRET Target Engagement Assay : Tag di fusione della luciferasi combinato con composti traccianti etichettati che, quando si trovano in prossimità della luciferasi, porteranno al trasferimento di energia di risonanza della bioluminescenza (BRET). Il legame composto nella stessa tasca sposterà il tracciante e il segnale BRET diminuirà. Questo non è un metodo di shock termico.
• DiscoverX InCELL Pulse: basato sulla tecnologia EFC (Enzyme Fragment Complementation) : la proteina bersaglio è fusa con un piccolo frammento di donatore enzimatico di β-galattosidasi (β-gal). Una proteina reporter aggiunta si legherà a questo frammento per ricostituire un enzima attivo, che idrolizzerà un substrato e genererà un segnale chemiluminescente che consente la quantificazione dell’abbondanza proteica. Dopo la denaturazione del calore, la proteina aggregherà e limiterà l’accesso del componente luciferasi più grande al suo partner sul bersaglio proteico.

La differenza fondamentale tra questi sistemi “recombinant CETSA®” o “recombinant target engagement” e Alpha CETSA®, è che non possono essere applicati a cellule native e non modificate. Questo ha una serie di conseguenze negative:

1. Mentre il costo per lo sviluppo di un anticorpo romanzo coppia e la successiva per bene i costi possono essere superiori a semplicemente transfecting una singola linea cellulare, è probabile che qualsiasi programma di ricerca vuole essere testato con una varietà di linee cellulari modello, ogni trasfezione viene con i suoi costi e la clonazione delle successive linee di cellule richiederà ulteriori settimane.
2. La generazione di una proteina taggata avrà sempre conseguenze fisiologiche sulla cellula e la proteina taggata potrebbe essere (i) sovraespressa (stechiometria errata vs. partner), (ii) non situati nel compartimento cellulare corretto o (iii) non associati alle proteine partner chiave e (iv) possono avere un comportamento di fusione diverso rispetto alla proteina nativa. Il che significa che l’effetto apparente di un composto potrebbe non riflettere il suo comportamento reale nel tessuto del paziente. Questi problemi possono essere amplificati in qualsiasi sistema di trasfezione temporanea.
3. Gli inibitori della Luciferasi possono provocare falsi positivi.
4. Nelle fasi successive dell’ottimizzazione del piombo quando sono necessari modelli cellulari più complessi e fisiologicamente più rilevanti (linee cellulari primarie, native e tessuti), gli approcci proteici etichettati semplicemente non sono applicabili.

D: Quali informazioni fornisce un dosaggio CETSA®?

A: CETSA ® fornisce una misura unica di un composto ‘sulla presenza del bersaglio’ e può essere pensato come occupazione del bersaglio. Questa occupazione sarà influenzata sia dalla capacità dei composti di impegnare il bersaglio che dalla capacità del composto di essere presente nella posizione giusta (cioè ha la giusta solubilità, permeabilità, stabilità metabolica e disponibilità nel compartimento cellulare destro). Le analisi non cellulari di impegno dell’obiettivo offrono le misure di affinità che si correlano soltanto con il comportamento della proteina negli ambienti altamente artificiali facendo uso spesso delle proteine dell’obiettivo ricombinate purificate.

D: CETSA® può essere utilizzato per studi di analisi SAR?

A: Non ci sono ancora esempi pubblicati in cui CETSA® sia stato utilizzato per l’ottimizzazione dei composti. Tuttavia, il potenziale e l’applicabilità di CETSA® da utilizzare per l’analisi SAR e la conferma dell’hit sono stati chiaramente dimostrati da Shaw et al. dal confronto dei dati del test CETSA® con i dati di analisi biochimici e cellulari comunemente usati (Shaw et al. 2018 SLA Discovery 1-12 DOI: 10.1177/2472555218813332). La pubblicazione dimostra il valore aggiunto di CETSA® per lo screening, la conferma hit e la generazione SAR per due target proteici: B-Raf e PARP1.

Tipi di target/campione

D: Quanti target sono stati validati in CETSA® finora?

A: In CETSA ® HT (la maggior parte è Alfa CETSA® , alcuni usano HTRF) più di 30 bersagli sono stati validati con successo, inclusi bersagli con localizzazione nucleare, mitocondriale, citoplasmatica e della membrana plasmatica.

Più di 100 obiettivi sono stati validati finora in CETSA ® Classic (Western Blot based detection).

CETSA ® M / S genera informazioni per 6000-7000 target contemporaneamente.

D: Tutte le proteine bersaglio possono essere testate in CETSA®?

R: Alcuni obiettivi sono “ciechi” in CETSA®, cioè il legame composto non cambierà la loro stabilità termica. Ciò può accadere quando la proteina ha più domini e il composto si lega a un solo dominio e se la stabilizzazione di questo singolo dominio non influisce globalmente sulla stabilità termica dell’intera proteina. Ci sono alcune proteine che non si sciolgono nel tipico intervallo di temperatura applicato negli esperimenti CETSA®.

Pelago ha accesso a un ampio database con dati di stabilità termica provenienti da progetti con lettura spettrometrica di massa (CETSA® MS), e queste informazioni vengono prese in considerazione quando Pelago sta valutando la “bilità CETSA®” di un target proteico prima di sviluppare un test Alfa CETSA®. Si prega di contattare Pelago per richiedere tali informazioni.

D: I GPCR sono suscettibili di CETSA® ?

A: Alcuni esempi di GPCR sono stati testati in CETSA® . In una recente pubblicazione di Astra Zeneca (Kawatkar et al Chem Biology 2019) I test CETSA® Classics sono stati stabiliti per un insieme di proteine legate alla membrana, tra cui un obiettivo proteico GPCR. Una potenziale sfida con CETSA® su GPCR può essere la disponibilità limitata di anticorpi per il rilevamento. Inoltre, la localizzazione integrale della membrana dei GPRCS può portare a un comportamento di fusione imprevedibile.

D: Che tipo di campioni possono essere testati in CETSA®?

A : Esistono esempi di test CETSA® che utilizzano diversi tipi di matrici, tra cui linee cellulari immortalate, cellule primarie, cellule iPS, PBMC derivati dal paziente, sferoidi, frazioni nucleari da cellule coltivate, tessuti trattati ex-vivo, tessuti da studi su animali in vivo, batteri, lieviti, pesci zebra e insetti.

Q: I campioni possono essere congelati dopo la fase di riscaldamento?

A: Ciò è possibile, tuttavia ciò richiede una convalida caso per caso in quanto il processo di congelamento può denaturare alcune proteine.

Q: Le mie cellule hanno bisogno del rivestimento del piatto della coltura con alcune proteine (per esempio collagene o Matrigel) ; è necessaria una cura speciale per evitare la preparazione del campione?

A: Non abbiamo riscontrato problemi con le cellule coltivate su piastre rivestite.

Condizioni di dosaggio CETSA®

D: Quali sono i tipici punti di ottimizzazione del dosaggio Alpha CETSA®?

A: Se si parte da zero, il dosaggio immunologico deve essere sviluppato e ottimizzato prima. È importante e utile investire nello sviluppo di un saggio Alfa molto sensibile, in quanto consentirà di ridurre il numero di cellule per pozzetto necessario nel test CETSA®. Poiché il test CETSA ® sta distruggendo parte della proteina che deve essere rilevata, in genere sono necessarie più cellule / pozzetti in un test CETSA® rispetto ad altri test basati sulle cellule. Si prega di fare riferimento alle guide PerkinElmer per lo sviluppo di alpha assay per come procedere e per suggerimenti utili, e ai manuali CETSA® toolbox se si utilizza l’approccio toolbox (anti mouse Ig X anti rabbit Ig beads).

Quindi i punti di ottimizzazione del dosaggio CETSA ® includono:

• densità di Cella di titolazione
• Selezione della cella di tampone di lisi
• tempo di Incubazione delle cellule con il composto di prova
• Temperatura di incubazione delle cellule con il composto di prova
• Stabilire sciogliere e spostamento delle curve
• Selezione della temperatura isotermica esperimenti di dose-risposta
• Flusso di lavoro e di automazione impostazioni

Q: Perché sono diversi CETSA® cell lysis buffer fornito e qual è l’impatto dell’utilizzo di diversi buffer di lisi cellulare?

A: Il tampone di lisi è importante per diversi aspetti del test. Il suo ruolo è multiplo: lisare le cellule e potenzialmente liberare la proteina bersaglio dalle proteine partner che possono interferire con il riconoscimento degli anticorpi, al fine di rendere il bersaglio disponibile per la rilevazione da parte degli anticorpi; stabilizzare la proteina bersaglio per rendere stabile il test; evitare o minimizzare il potenziale effetto epiturbance; fornendo le giuste condizioni fisico-chimiche (pH, forza ionica e natura dei sali, tipo di detergente e concentrazione, … ) per il saggio immunologico, As Poiché diversi saggi immunologici possono avere diverse condizioni ottimali e diversi bersagli proteici e diversi tipi di cellule possono avere requisiti diversi per prestazioni ottimali del saggio, stiamo rendendo disponibili 5 diversi tamponi di lisi cellulare. Questi forniscono una varietà di condizioni di lisi cellulare. Tuttavia, ciò non implica che in casi specifici possano essere aggiunti componenti aggiuntivi, come tipi di detergenti aggiuntivi, per migliorare ulteriormente le prestazioni del dosaggio.

D: Ci sono inibitori della proteasi nei buffer di lisi cellulare CETSA®?

A: I tamponi per lisi cellulare CETSA® 1, 4 e 5 contengono alcuni chelanti dei cationi bivalenti, che dovrebbero inibire le proteasi che richiedono tali cationi bivalenti per la loro attività (metalloproteinasi della matrice per esempio). Oltre a questo, nessun altro inibitore della proteasi è incluso nei buffer di lisi cellulare CETSA ® in quanto questi non sono generalmente necessari per le prestazioni dei test Alfa CETSA®. Tuttavia, per specifici tipi di cellule o campioni di tessuto, è possibile aggiungere inibitori tipici della proteinasi, come leupeptin.

D: Quali sono le tipiche temperature di fusione?

A: La temperatura di fusione (Tm) è definita come la temperatura alla quale metà della popolazione proteica target è stata denaturata (cioè in Alfa CETSA® alla quale metà del segnale Alfa è stata persa). A seconda dell’obiettivo, le temperature di fusione sono più spesso comprese tra 40°C e 60°C, con una temperatura media di fusione di 52°C. Alcune proteine, come le proteine associate alla membrana, sono solitamente più stabili e possono avere una temperatura di fusione più elevata. I dati del test CETSA® per le proteine con una temperatura di fusione superiore a 65°C possono essere influenzati dal fatto che la permeabilità della membrana e l’integrità cellulare sono perturbate quando le cellule vengono riscaldate, influenzando così il significato fisiologico del test.

Nella nostra esperienza, la temperatura di fusione è target-specifica e dipende dalla matrice di analisi e dal buffer di lisi utilizzato.

D: La Tm dovrebbe essere la stessa quando si lavora con cellule intatte e cellule interrotte?

A: Non necessariamente, come quando si interrompono le cellule, le interazioni proteina-proteina che stabilizzano le proteine possono essere perse, il che può portare a una temperatura di fusione modificata rispetto alle cellule intatte. Per un esempio, fare riferimento ai dati del dosaggio Alpha CETSA® MEK1.

Q: Che temperatura di riscaldamento dovrei selezionare per la prova composta?

A: Per i composti stabilizzanti si consiglia di selezionare la temperatura più bassa con la finestra di dosaggio più grande, poiché si prevede che fornisca il dosaggio più sensibile (valori EC50 inferiori). Per i composti destabilizzanti si consiglia di selezionare la temperatura più alta con la finestra di analisi più grande. Temperature superiori a 65°C possono avere un impatto sulla permeabilità cellulare e ridurre il significato dei dati.

D: Dovrei aspettarmi la stessa temperatura di fusione in CETSA ® Classic (Western Blot) e Alpha CETSA®?

A: Non necessariamente: la temperatura di fusione apparente può variare tra entrambi i metodi, perché i metodi di rilevamento sono diversi.

Q: È importante avere un controllo rigoroso dei tempi di riscaldamento del campione?

A: Sì questo è estremamente importante da controllare poiché tempi di riscaldamento più lunghi possono comportare uno spostamento corretto della curva dose-risposta (vedere sotto i commenti sul tempo di permanenza). Il tempo di riscaldamento standard è di 3 minuti.

Composti con un breve tempo di permanenza (cioè alta costante di dissociazione koff; il tempo di permanenza T è uguale a 1 / koff) si dissocierà più velocemente dal bersaglio quando viene riscaldato, rispetto ai composti che hanno un lungo tempo di permanenza. Per questo motivo, il valore EC50 o ITDRF50 dovrebbe aumentare con l’aumentare dei tempi di riscaldamento. Per ulteriori spiegazioni sulla teoria CETSA® vedere Seashore-Ludlow B, Axelsson H, Almqvist H, Dahlgren B, Jonsson M, Lundbäck T. (2018) Interpretazione quantitativa del legame intracellulare e della cinetica dei farmaci utilizzando il test dello spostamento termico cellulare. Biochimica 57: 6715-6725. https://dx.doi.org/10.1021/acs.biochem.8b01057. In teoria, il rilevamento di diversi composti tempi di residenza al bersaglio, variando il tempo di riscaldamento potrebbe essere possibile, ma non ci sono rapporti pubblicati ancora disponibili su questo essendo stato fatto.

Q: Il manuale indica di raffreddare su ghiaccio o per 3 minuti a 25°C dopo lo shock termico. Questo passaggio di raffreddamento è importante ed è importante avere un controllo rigoroso del tempo di raffreddamento?

A: Il raffreddamento del campione rapidamente assicura che la fase dello shock termico sia controllata bene. Semplicemente permettendo che le temperature si raffreddino senza aiuto certamente produrrebbe i tassi di raffreddamento differenti in pozzi differenti e colpirebbe la quantità di scossa termica consegnata al sistema. La fase di raffreddamento non è così critica come la fase di riscaldamento, ma dovrebbe essere condotta in modo rapido e coerente.

D: Posso utilizzare i kit PerkinElmer “Biomarker” e “SureFire” (non-CETSA®) per eseguire un test CETSA®?

A: In teoria qualsiasi saggio di proteine totali può essere adatto per l’uso in un protocollo CETSA®, anche se ogni sistema deve essere ottimizzato e validato. Tuttavia, il metodo CETSA® è brevettato e sarà necessaria l’autorizzazione da Pelago Bioscience. Inoltre, solo l’uso dei kit di destinazione designati sono supportati da PerkinElmer. L’uso del kit tool box è supportato da Pelago Bioscience ed è disponibile solo per i titolari di licenza.

D: È possibile leggere il segnale Alfa direttamente dalla piastra PCR utilizzata per riscaldare i campioni?

R: Ciò offrirebbe vantaggi in termini di numero di passaggi di pipettaggio, consumo del campione e facilità di automazione, ma la possibilità di utilizzare piastre PCR per l’intero processo – dal trattamento del campione al rilevamento – non è ancora dimostrata. Le piastre PCR sono spesso molto flessibili, portando a un segnale non uniforme sulla piastra, o non hanno le giuste dimensioni per consentire loro di essere gestite dai lettori di lastre. Bene-a-bene cross-talk può anche essere un problema in tali piastre PCR.

D: Si può usare la denaturazione chimica (ad esempio utilizzando urea o guanidina) al posto del calore?

A: Il vantaggio di utilizzare la temperatura per fornire lo shock termico è che è fatto in un modo altamente controllato che è probabile che sia costante tra i campioni e limitato in un lasso di tempo ben controllato. Un processo di denaturazione chimica potrebbe funzionare in un estratto proteico purificato; ma nell’ambiente cellulare complesso, la variazione del volume cellulare, la capacità di buffering, il contenuto lipidico ecc.

Poiché la denaturazione (tempo di riscaldamento) è fondamentale, questo può essere abbastanza difficile da controllare se si utilizza la denaturazione chimica. Inoltre, il calore può essere applicato senza interrompere le cellule, consentendo di testare in un contesto cellulare reale. Questo non sarebbe il caso della denaturazione chimica, poiché le cellule dovrebbero essere interrotte per consentire l’accesso target all’agente denaturante, perdendo quindi concentrazioni intracellulari, associazioni proteiche ecc.. Pertanto non è consigliabile sostituire lo shock termico con denaturazione chimica.

Immunodosaggio Alfa CETSA®

Q: Quando si sviluppa un test CETSA®, ho bisogno di anticorpi monoclonali o si possono usare anche anticorpi policlonali?

A: Possono essere utilizzati sia anticorpi monoclonali che policlonali, a seconda ovviamente della qualità degli anticorpi. Gli anticorpi monoclonali presentano un vantaggio in termini di fornitura stabile di reagenti, come per qualsiasi altro metodo di rilevamento che utilizza anticorpi.

D: Quando si utilizzano anticorpi policlonali, il lotto successivo funzionerà allo stesso modo in un test CETSA®?

A: Nella nostra esperienza, non abbiamo mai affrontato una situazione in cui il lotto successivo di un anticorpo policlonale si comportasse in modo diverso nel test CETSA® rispetto ai lotti precedenti. Tuttavia, il test CETSA ® deve essere convalidato con il lotto successivo dell’anticorpo policlonale.

Q: Ci sono altre raccomandazioni per la selezione degli anticorpi?

A: Se disponibili, gli anticorpi devono essere selezionati in modo da coprire diversi epitopi della proteina bersaglio, al fine di massimizzare le possibilità di trovare una coppia di anticorpi adatta che funzionerà nel test Alpha CETSA®.

Coppie di anticorpi che producono curve più ripide (pendenza della collina più elevata) e meno sfondo sono preferiti in quanto di solito forniscono un segnale più specifico. Il pendio basso della collina può essere il segno della capacità di una coppia dell’anticorpo di riconoscere la proteina ripiegato.

D: Gli anticorpi Alfa CETSA® sono solo contro la proteina bersaglio endogena o la proteina bersaglio endogena più piccola molecola legata?

A: Sulla base dei kit sviluppati finora, gli anticorpi sono solo contro il bersaglio proteico.

Q: Posso aspettarmi che le affinità anticorpali di rilevamento siano diverse tra piccole molecole legate e non legate alla proteina bersaglio?

A: Piccole molecole che influenzano il ripiegamento delle proteine nei siti epitopi sono effettivamente a rischio di alterare il legame anticorpale. Questo fenomeno è chiamato ” epiturbance “e può essere una limitazione dell’anticorpo basato-CETSA®. L’epiturbanza non è generalmente osservata nel formato di dosaggio classico CETSA® (Western Blotting) poiché in questo caso la proteina viene completamente denaturata prima della fase di rilevamento degli anticorpi.

D: Con i kit CETSA® toolbox si possono usare solo IgG?

A: In effetti, gli anticorpi sulle perle anti-coniglio e anti-topo sono specifici per le IgG e non riconoscerebbero altre classi di anticorpi (ad esempio IgA, IgM, ecc.).

D: C’è un vantaggio nell’utilizzo di Alpha CETSA® rispetto a CETSA ® Classic (Western Blotting)?

A: Oltre a una maggiore sensibilità del test Alpha CETSA® e a considerazioni di throughput e automazione, a causa della possibile difficoltà nell’analisi delle proteine di membrana nel metodo classico CETSA®, Alpha CETSA ® può funzionare meglio per tali obiettivi, in quanto non necessita di alcuna fase di separazione.

Analisi e interpretazione dei dati CETSA®

D: Quali risultati falsi positivi possono essere ottenuti in CETSA®?

A: La stabilità termica di alcune proteine può essere influenzata dopo il trattamento con il composto, anche se non sono direttamente legate dal composto in esame. Questi effetti indiretti possono essere il risultato, ad esempio, della fosforilazione proteica, del reclutamento proteico da parte di una proteina partner o del cambiamento generale dello stato Redox della cellula. L’esecuzione del test CETSA® in parallelo su cellule intatte e su cellule interrotte può discriminare tra effetti diretti e indiretti, in quanto tali effetti indiretti non sono previsti quando le cellule vengono interrotte e i processi metabolici vengono fermati.

L’intereferenza del saggio composto può essere riscontrata in Alpha CETSA® poiché i composti sono presenti nella fase di rilevamento ad una concentrazione relativamente alta. Questo può dare risultati fuorvianti ed è importante eseguire uno schermo contatore per identificare questi composti.

D: Come si può interpretare la destabilizzazione mirata?

A: La destabilizzazione può derivare dall’interruzione del legame composto di un complesso proteico che stava stabilizzando la proteina bersaglio. Nella nostra esperienza, le proteine di membrana di solito hanno una temperatura di fusione più elevata e sono piuttosto destabilizzate che stabilizzate dal legame composto. Per le chinasi, potrebbe anche derivare dallo spostamento di ATP. In tal caso, può essere utile confrontare il risultato delle analisi CETSA® quando eseguite su cellule intatte (concentrazioni fisiologiche di ATP) e cellule interrotte (perdita di ATP). Per alcuni obiettivi (vedere il manuale del kit ErbB2 Alpha CETSA® ) abbiamo osservato che inibitori irreversibili stavano destabilizzando il bersaglio mentre un inibitore reversibile stava stabilizzando il bersaglio.

D: C’è un modo per evitare l’effetto epiturbance?

A: L’aggiunta di una piccola quantità di detersivo, come 0.01% SDS, può impedire il fenomeno epiturbance. Una spiegazione potrebbe essere che SDS sta fornendo l’accesso all’anticorpo anche in presenza del composto. Alcuni dei buffer di lisi cellulare CETSA ® contengono una piccola quantità di SDS e pertanto possono evitare l’epiturbanza rispetto ad altri buffer di lisi. Non possiamo escludere che potrebbe essere necessario aggiungere più SDS in alcuni casi.

Va notato che tale effetto epiturbante non è limitato ai saggi CETSA®, ma può anche essere riscontrato in qualsiasi saggio immunologico.

D: Counter-screen / Come verificare se il mio hit CETSA® è un falso positivo?

A: In CETSA®, esiste un metodo semplice che consente di determinare se il composto agisce sulla stabilizzazione della proteina bersaglio (de)stessa o interferisce con il metodo di rilevamento: un confronto può essere fatto tra (1) aggiunta dei composti alle cellule, quindi incubando e facendo il trattamento termico e (2) riscaldando le cellule prima e aggiungendo il composto solo dopo. Se l’attività composta si trova solo nel test 1, allora è veramente attiva sul bersaglio. Se l’attività composta si trova in 1 e 2, mostra che interferisce in qualche modo con la tecnologia di rilevamento (fare riferimento alla guida all’interazione proteina-proteina PerkinElmer per un elenco di potenziali interferenze alfa).

D: Quali risultati falsi negativi possono essere ottenuti in CETSA®?

A: Se un composto non raggiunge l’obiettivo in un contesto cellulare, può apparire positivo nei test biochimici e essere ancora negativo in CETSA® . Questo non è un falso negativo, ma riflette solo il fatto che il composto non è in grado di accedere al bersaglio in condizioni cellulari reali, che fa parte della potenza del metodo.

D: Come si confrontano i valori CETSA® con i test funzionali / esiste un significato dell’ampiezza del thermoshift?

A: Quando si analizzano i dati CETSA®, si deve tenere presente che il principio del test è molto diverso dai tipici test funzionali, come la fosforilazione delle proteine, le concentrazioni di ioni, il cAMP e altri marcatori di trasduzione del segnale, o l’analisi fenotipica nello screening ad alto contenuto, e quindi i dati devono essere interpretati di conseguenza.

L’ampiezza del thermoshift NON è una misura dell’affinità composta.

I valori EC50, o ITDRF50, sono specifici per determinate condizioni di dosaggio (temperatura, tempo di riscaldamento, …). Questo non è diverso dai test funzionali, dove i valori EC50 sono ad esempio specifici per i tempi di stimolazione.

D: È possibile discriminare gli antagonisti rispetto agli agonisti nei test CETSA®?

A: Normalmente questa non è un’informazione che viene estratta dai test CETSA®, ma dalla pubblicazione di Shaw et al. (2018) RAPPORTI scientifici | (2018) 8: 163 / DOI: 10.1038 / s41598-017-18650-x. rapporti che solo gli agonisti sono stati in grado di stabilizzare il recettore degli androgeni nel test CETSA® sviluppato, mentre l’antagonista non ha avuto alcun effetto diretto nel test CETSA®, ma potrebbe essere rilevato come concorrenti dell’effetto degli agonisti nel test CETSA®. Pertanto in questo caso particolare il test CETSA® è stato in grado di discriminare tra agonisti del recettore degli androgeni e antagonisti. Ciò non implica che ciò sia possibile per qualsiasi target, in quanto vi sono numerosi esempi in cui il test CETSA® rileva direttamente sia agonisti che antagonisti.

Q: CETSA® può essere utilizzato per rilevare la tossicità di un composto?

A: Ci si aspetta che i composti che esercitano un qualche effetto tossico su una cellula portino a cambiamenti nel livello di alcune proteine (tramite degradazione e/o effetti trascrizionali) e a cambiamenti nella termostabilità di alcune proteine (tramite modifiche post-traduzionali o cambiamenti generali dello stato Redox delle cellule). Pelago sta esplorando la possibilità di generare “impronte digitali CETSA®” che potrebbero essere collegate a diversi tipi di tossicità, dai dati CETSA® MS. Ciò potrebbe anche generare la conoscenza degli obiettivi che i farmaci non dovrebbero colpire per evitare tale tossicità. Se un obiettivo specifico sembra essere collegato alla tossicità, l’uso di Alpha CETSA ® può diventare un metodo di scelta per l’industria farmaceutica.

D: Una proteina di pulizia può essere utilizzata per la normalizzazione dei test CETSA®?

A: La normalizzazione non è tipicamente necessaria nei test CETSA®, poiché l’output importante del test è il valore EC50. Tuttavia, in alcuni casi, ad esempio quando si lavora con campioni di tessuto, la quantità di materiale impegnato per datapoint può variare in modo significativo e la normalizzazione può quindi essere desiderata. In CETSA ® Classic (Western blotting), SOD1 è comunemente usato come il suo punto di fusione di 80°C lo rende un buon riferimento invariabile per qualsiasi bersaglio, e come il suo peso molecolare di 18 kDa lo rende facile da rilevare su Western blots. GAPDH non sarebbe raccomandato a causa della sua temperatura di fusione più bassa (55 °C), rendendolo non un possibile controllo per obiettivi con una temperatura di fusione più elevata.

Se si desidera normalizzare il test Alpha CETSA®, è possibile provare cofilin (esiste un kit AlphaLISA SureFire ultra per cofilin totale, con dati preliminari CETSA® ma nessun kit completamente convalidato ancora)