Anticorpo targeting di claudin-1 come un potenziale cancro del colon-retto terapia

campioni di CRC

Per analisi di espressione genica, abbiamo selezionato 143 campioni di tumore da 143 pazienti inclusi in tre gruppi: il potenziale del singolo centro di studio REGP (19 pazienti) (GSE62322) , la retrospettiva multi-center, studio COSIVAL (68 pazienti) e la prospettiva multi-center, studio BIOCOLON (56 pazienti) (GSE62080 e GSE72970) . Per questi tre studi, i criteri di inclusione erano: adenocarcinoma del colon istologicamente provato, tumore avanzato e bidimensionale misurabile (stadio IV), età compresa tra 18 e 75 anni e performance status ≤2 dell’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS). Prima di qualsiasi trattamento, tutti i pazienti sono stati sottoposti a intervento chirurgico per resezione tumorale primaria o biopsia endoscopica.

Per l’analisi western blot, sono stati utilizzati 13 campioni di tumore aggiuntivi dallo studio prospettico a centro singolo REGP ma non inclusi nei 143 campioni.

Per l’analisi immunoistochimica, campioni di tessuto di 52 ulteriori pazienti con CRC sono stati selezionati retrospettivamente dall’Istituto di ricerca sul cancro di Montpellier pathology files solo quando erano disponibili campioni di mucosa normale, adenoma e adenocarcinoma per lo stesso paziente.

Tutti gli studi che utilizzano campioni di tessuto umano sono stati approvati dai comitati etici competenti e tutti i partecipanti sono stati informati sugli obiettivi e sui metodi dello studio e hanno firmato un consenso informato scritto prima dell’iscrizione.

Analisi dell’espressione genica

Campioni di colon (campioni di colon normale, tumore primario e metastasi epatiche per lo studio REG/P, ma solo campioni di tumore primario per gli studi COSIVAL e BIOCOLON) sono stati raccolti al momento dell’intervento chirurgico seguendo una procedura standardizzata per ottenere RNA di alta qualità . I campioni sono stati poi ibridati al genoma umano U133 Plus 2.0 array (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA).

Per identificare nuovi target terapeutici per la terapia basata su anticorpi in mCRC, abbiamo confrontato i profili di espressione genica di campioni di tessuto mucosa normale (n = 17), tumore primario (n = 20) e metastasi epatiche (n = 19).

Poiché l’eterogeneità CRC deve essere presa in considerazione quando si confrontano i profili di espressione genica, i campioni tumorali primari (n = 143) sono stati classificati utilizzando le classificazioni molecolari CRC basate su profili di espressione genica che sono stati proposti da tre gruppi indipendenti e la recente classificazione di consenso . In breve, De Sousa E. Melo et al. proposto di raggruppare i tumori in tre classi: CCS1 (CRC con instabilità microsatellite, MSI), CCS2 (cancro con instabilità cromosomica, CIN) e CCS3 (nuovo sottotipo) . Sadanandam et al. identificati cinque sottotipi molecolari, basati sul fenotipo cellulare: Calice-like, Transit-Amplifying (TA), Enterocyte, Stem-like e infiammatorio . Marisa et al. descritti sei sottotipi molecolari (da C1 a C6) con le seguenti caratteristiche principali: C1 = CIN e downregulation delle vie immunitarie, C2 = MSI, C3 = KRAS mutato, C4 = stem cell phenotype-like, C5 = CIN e upregulation delle vie WNT, e C6 = CIN e normal-like gene expression profile . Infine, a partire da sei firme precedentemente pubblicate, un consorzio internazionale ha presentato una classificazione con quattro sottotipi di consenso: MSI (CMS1), canonical (CMS2), metabolic (CMS3) e mesenchymal (CMS4) (per la revisione ). La distribuzione del campione CRC secondo il sottotipo molecolare è mostrata nel file aggiuntivo 1: Tabella S1.

Analisi immunoistochimica

I campioni sono stati assemblati in un micro-array tissutale (TMA) utilizzando tre nuclei di tessuto (diametro 0,6 mm ciascuno) come descritto in precedenza . In breve, le sezioni 3-µm del TMA sono state de-paraffinizzate e reidratate in alcoli graduati. Il recupero dell’antigene indotto dal calore è stato eseguito incubando sezioni di TMA in tampone EDTA (pH 9) a 98 °C in un bagno d’acqua per 20 min. Dopo la neutralizzazione dell’attività endogena della perossidasi, le sezioni di TMA sono state incubate con un anticorpo policlonale anti-CLDN1 (JAY-8, Zymed laboratories Inc, CA, USA) o un diluente anticorpale (Dako, Glostrup, Danimarca) da solo per 60 min. Il legame anticorpale primario è stato visualizzato utilizzando il sistema Envision® e il Dako Autostainer® (Dako, Glostrup, Danimarca). La percentuale di cellule CLDN1-positive e l’intensità di colorazione (0, nessuna colorazione; 1, giallastro; 2, marrone; e 3, marrone scuro) sono state valutate per ogni singolo spot TMA.

Western blot analisi

Tumore campioni di tessuto da pazienti sono stati direttamente macinati in tampone di lisi (150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7.4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% SDS, 1% Triton X-100, 0.5% NP-40, 2 mM PMSF, 100 mM NaF, 10 mM di sodio orthovanadate, un cocktail inibitore della proteasi tablet per 10 ml) con un Mixer Mill® MM 300 unità (Qiagen, Valencia, CA). La concentrazione proteica è stata determinata con il test di Bradford (Pierce Coomassie Plus Protein Assay). Quindi, 50 µg di proteine totali sono state risolte dal 12% di SDS-PAGE e trasferite su membrane di nitrocellulosa (Whatman® Protran®, dimensione dei pori 0,45 µm). I siti di legame non specifici sono stati bloccati con latte non grasso al 5% (wt/vol) in PBS con 0,1% (vol/vol) tra 20 (PBS-T) a temperatura ambiente per 1 h e poi le membrane sono state incubate a 4 °C con un anticorpo policlonale anti-CLDN1 (JAY-8) durante la notte. Le membrane sono state quindi lavate e incubate con l’anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano appropriato per 1 h. La rivelazione è stata eseguita con un sistema di chemiluminescenza (Amersham Biosciences); l’espressione β-tubulina è stata utilizzata per la normalizzazione.

Estrazione di proteine subcellulari

L’estrazione di proteine è stata effettuata come descritto in precedenza . Per ogni campione, sezioni spesse 20 µm sono state tagliate con un criotomo, mescolate in azoto liquido e macinate delicatamente con un micro-pestello. Per l’estrazione di proteine subcellulari, il kit di estrazione del proteoma subcellulare ProteoExtract è stato utilizzato secondo le istruzioni del produttore (Calbiochem). Le frazioni subcellulari (10 µg/ciascuna) sono state caricate su gel 12% SDS-PAGE. Immunoblotting è stato fatto come descritto sopra con i seguenti anticorpi primari: anti-CLDN1 (JAY-8), -CD71 (Invitrogen), -Istone H3 (Pierce) e-β-tubulina (Sigma T4026).

Linee cellulari

Sono state utilizzate le seguenti linee cellulari CRC umane: SW480 (ATCC CCL-228), SW620 (ATCC CCL-227), Caco-2 (ATCC HTB-37), Difi (un regalo di C. Montagut, Dipartimento di Oncologia medica, Hospital del Mar, Barcellona, Spagna), HCT116 (CCL-247) e LS174T (ATCC CL-188). Per ottenere la linea cellulare SW480 CLDN1-positiva (SW480-CLDN1), le cellule SW480 sono state trasfettate stabilmente con il clone di cDNA CLDN1 umano (Invitrogen MGC collection) o con vettore vuoto (pcDNA) utilizzando il reagente di trasfezione jetPRIME™ (Polyplus-transfection Inc., France). Cloni CLDN1-positivi sono stati selezionati crescendo cellule transfettate in presenza di 500 µg / ml di geneticina. Per il silenziamento CLDN1, SW620 è stato trasdotto con il vettore pSIREN contenente lo shRNA contro CLDN1 (SW620shCLDN1) o contro luciferasi (shLUC, controllo negativo). Dopo 24 ore, le cellule sono state selezionate con 1 µg/mL di puromicina e i cloni stabili sono stati raggruppati. Tutte le trasfezioni transitorie sono state effettuate utilizzando il reagente per trasfezione jetPRIME™.

Produzione di anti-CLDN1 MAB 6 F6

Per la produzione di anticorpi, topi BALB/c femmina di 6-8 settimane (Harlan, Gannat, Francia) sono stati sfidati dall’iniezione intra-peritoneale (ip) di 4 milioni di cellule NIH di topo transitoriamente trasfettate con CLDN1 cDNA (cellule NIH-CLDN1) ogni due settimane (cinque iniezioni in totale). Le cellule NIH-CLDN1 sono state mescolate con l’adiuvante completo di Freund (Sigma) per la prima iniezione e con l’adiuvante incompleto di Freund (Sigma) per le altre quattro iniezioni. Un’iniezione endovenosa di richiamo di cellule NIH-CLDN1 è stata somministrata tre mesi dopo la quinta immunizzazione. Tre giorni dopo, le cellule della milza di topi immunizzati sono state fuse con la linea cellulare del mieloma di topo P3-X63-Ag.8.653 per produrre ibridomi di topo. I supernatanti provenienti da cloni appena generati sono stati sottoposti a screening mediante selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) utilizzando cellule SW480-CLDN1 e SW480 (controllo negativo). I risultati dello screening sono stati confermati eseguendo uno screening aggiuntivo utilizzando cellule SW620 e SW620-shCLDN1. Il clone anti-CLDN1 hybridoma 6 F6 è stato selezionato e clonato limitando la diluizione. L’isotipizzazione degli anticorpi ha mostrato che 6 F6 era un I3k.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida del governo francese per gli studi sperimentali sugli animali (accordo CEEA-LR-12052).

Radiomarcatura e imaging SPECT-CT

Topi nudi atimici femminili (di età compresa tra 6 e 8 settimane) sono stati acquistati da Harlan. Il 6 F6 mAb è stato radiomarcato con 125I (Perkin Elmer) all’attività specifica di 370 MBq/mg per la tomografia computerizzata a emissione di singolo fotone (SPECT), utilizzando lo IODO-GEN (Pierce Chemical Co.) metodo. Dopo l’iniezione della vena di coda di 16 MBq/50 µg 6 F6 marcati con 125I, sono state acquisite immagini di tomografia a emissione di fotoni singoli a tutto il corpo/tomografia computerizzata (SPECT/CT) con una telecamera NanoSPECT multi-pinhole multiplexing a 4 teste (Bioscan Inc., Washington, USA) in vari momenti (48, 72 e 96 h). Contemporaneamente, sono state acquisite immagini micro-CT di tutto il corpo per la co-registrazione anatomica con i dati SPECT. I dati SPECT e CT ricostruiti sono stati visualizzati e co-registrati utilizzando Invivoscope®.

Test clonogenico

Le cellule tumorali del colon-retto sono state seminate in una piastra a 6 pozzetti (150, 250 o 400 cellule/pozzetto) e lasciate aderire a 37 °C durante la notte. Quindi, 1 ml di RPMI con o senza 6 F6 mAb (concentrazione finale: 100 µg/ml) è stato aggiunto a ciascun pozzetto e le cellule sono state coltivate per sei giorni. Dopo altri sei giorni in ambiente privo di anticorpi, le piastre sono state lette utilizzando un citometro per imaging Celigo™ e l’applicazione “Single colony verification”. Il citometro Celigo™ è un sistema di analisi cellulare da banco in situ che fornisce immagini di pozzi utilizzando l’illuminazione a campo luminoso (Nexcelom Bioscience, MA, USA).

Creazione di colture sferoidi tridimensionali (3D)

Attacco ultra-basso, piastre a 96 pozzetti a fondo tondo (Corning Costar) sono state utilizzate per la formazione di sferoidi. Le celle SW480, SW480-CLDN1 o SW620 sono state seminate a una densità di 5 × 104. Cellule aggregate e fuse in sferoidi 3D entro 24-72 h. Le immagini dei pozzetti sono state scattate con un microscopio a contrasto di fase utilizzando un obiettivo 5× o catturate con il citometro per imaging Celigo™ utilizzando l’applicazione” Tumorosphere”. La vitalità cellulare è stata valutata con il test di vitalità cellulare luminescente CellTiter-Glo (Promega, Madison, WI, USA). Dopo l’aggiunta di 100 µl di reagente CellTiter Glo a ciascun pozzetto per 10 min, la luminescenza è stata misurata su un lettore di micropiastre a luminescenza TriLux da 1450 MicroBeta (Perkin Elmer).

Analisi del ciclo cellulare e della proliferazione negli sferoidi

Gli sferoidi sono stati preparati placcando 1000 cellule DiFi per pozzetto in piastre a 96 pozzetti a bassissimo attacco e coltivandole in presenza di 100 µg/ml di 6 F6 mAb o MAB irrilevante (retuximab) per 5 giorni. Per l’analisi del ciclo cellulare, le cellule sono state pellettate, tripsinizzate, lavate con PBS, fissate in etanolo al 75% e colorate con 40 µg/ml di ioduro di propidio in presenza di 100 µg ml−1 RNasi (Qiagen). La distribuzione del ciclo cellulare è stata determinata con un citometro a flusso di coltro Beckman FC500 utilizzando il canale FL-3. Le cellule sono state gated su un puntino che ha visualizzato il DNA-impulso-picco vs l’area DNA-impulso per escludere doppietti. Le distribuzioni del ciclo cellulare sono state illustrate utilizzando il software di analisi Flow Jo (Treestar, FLOWJO, Ashland, OR, USA).

Al giorno 4 della coltura, la proliferazione cellulare è stata misurata incubando cellule con 5-etinil-2′-deossiuridina (EdU) per 24 ore. L’EdU è incorporato nel DNA durante la sintesi attiva del DNA. Quindi, dopo la tripsinizzazione cellulare e la fissazione / permeabilizzazione in etanolo / PBS al 75%, l’EdU incorporato è stato etichettato e rilevato con il kit di analisi per citometria a flusso Edu Alexa Fluor 488 (Invitrogen). Le cellule sono state quindi incubate con 1 µg/ml di 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) in PBS/0,1% Triton X100 a 37 °C per 30 min. L’applicazione Celigo™ “Expression Analysis” (Target 1 + Mask) è stata utilizzata per quantificare il segnale fluorescente e per l’analisi dei dati. Le cellule sono state identificate utilizzando la macchia nucleare DAPI e la sintesi del DNA è stata quantificata misurando l’incorporazione di EdU.

Modelli di xenotrapianto di topi

1,5 × 106 cellule SW620 o 3 × 106 cellule DiFi sono state sospese nel terreno di coltura e iniettate per via sottocutanea (s.c.) nel fianco destro di topi nudi atimici di 6-8 settimane di età di Harlan. Quando il volume del tumore ha raggiunto circa 100 mm3, i topi sono stati randomizzati in diversi gruppi e trattati con iniezione IP di NaCl 0,9% o 6F6 mAb (15 mg/Kg per iniezione) due volte a settimana per tre settimane consecutive per il primo esperimento e tre volte a settimana per il secondo esperimento. I tumori sono stati misurati bi-settimanalmente con una pinza e i volumi calcolati con la formula: D1 x D2 x D3 / 2.

Modello di colonizzazione epatica intrasplenica

In ogni esperimento, 2 milioni di cellule SW620 che esprimono luciferasi (cellule SW620-LUC) sono state iniettate nella milza di topi nudi atimici di 6-8 settimane di età. La milza è stata rimossa 2 min dopo l’iniezione cellulare. Il giorno 1 dopo l’iniezione, i topi sono stati divisi casualmente in due gruppi di topi 10 che sono stati trattati con 15 mg / kg di 6 F6 mAb o 0.9% NaCl per iniezione IP, tre volte alla settimana. Per valutare la formazione e la diffusione metastatica, l’espressione della luciferasi è stata monitorata mediante imaging a luminescenza dopo l’iniezione di luciferina (Camera Ivis Lumina II, PerkinElmer®) una volta alla settimana. Alla settimana 5 dopo l’intervento chirurgico, i topi sono stati sacrificati, i fegati sono stati rimossi, fotografati e sono state contate metastasi macroscopicamente visibili sulla superficie del fegato.

Analisi statistica

L’analisi statistica è stata effettuata utilizzando il software STATA 13.0 (StataCorp). Per gli esperimenti di espressione genica o immunoistochimica, le differenze tra i gruppi sono state analizzate utilizzando il test di Kruskall Wallis / Dunn. Le correlazioni tra espressione genica CLDN1 e sopravvivenza libera da progressione (PFS) e sopravvivenza globale (OS) sono state valutate nell’intero gruppo (n = 143 pazienti) e in base al sottotipo molecolare del tumore. A tal fine, i 143 pazienti sono stati divisi in due gruppi in base all’espressione genica mediana del CLDN1 (cioè, 9,75 ). I valori di PFS e OS sono stati confrontati utilizzando il metodo Kaplan-Meier e le differenze tra le distribuzioni di sopravvivenza valutate utilizzando il test log-rank.

Il t-test accoppiato è stato utilizzato per confrontare l’effetto dell’incubazione con il 6 F6 mAb in esperimenti in vitro.

In esperimenti in vivo, è stato utilizzato un modello di regressione lineare mista per determinare la relazione tra la crescita del tumore e il numero di giorni dopo l’iniezione. La parte fissa del modello includeva variabili corrispondenti al numero di giorni post-innesto e ai diversi gruppi di trattamento. I termini di interazione sono stati integrati nel modello; sono state incluse intercettazioni casuali e pendenze casuali per tenere conto dell’effetto temporale. I coefficienti del modello sono stati stimati in base alla massima verosimiglianza. I tassi di sopravvivenza sono stati stimati dalla data dell’iniezione fino alla data in cui il tumore ha raggiunto un volume di 1500 mm3 utilizzando il metodo Kaplan–Meier. Le curve di sopravvivenza sono state confrontate utilizzando il test log-rank. Per gli esperimenti di colonizzazione epatica, le differenze tra i gruppi sono state valutate con il test Mann-Whitney U. Per tutti gli esperimenti, le differenze sono state considerate significative quando P < 0,05.