Attività clastogenica della 2-clorodeossiadenosina nelle cellule somatiche dei mammiferi

MUTAGENESI
ARTICOLO DI RICERCA

Attività clastogenica della 2-clorodeossiadenosina nelle cellule somatiche dei mammiferi

Gilmara Ausech AntonucciI; Catherine He TakahashiI; II

Iuniversità di São Paulo, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Departamento de Genética, Ribeirão Preto, SP, Brasile.
IIUniversidade di São Paulo, Facoltà di Filosofia, Scienze e Lettere di Ribeirão Preto, Dipartimento di Biologia, Ribeirão Preto, SP, Brasile.

Corrispondenza

ABSTRACT

dell’analogo di base 2-clorodeossiadenosina (2-CdA) utilizzato per la terapia nei disturbi linfoproliferativi cronici resistenti e avanzati, è citotossico sia per i linfociti divisori che non divisori. Il presente lavoro ha valutato il potenziale clastogenico di questo farmaco in vitro in linfociti umani in coltura e in vivo in cellule di midollo osseo di topi BALB/C. Nei linfociti umani, l’effetto clastogenico di 2-CdA è stato studiato nelle fasi G1, S e G2 del ciclo cellulare, utilizzando tre diverse concentrazioni (10, 20 e 40 mg/mL). Gli endpoint analizzati includevano indice mitotico (MI), indice di proliferazione (PI), scambio cromatidico sorella (SCE) e aberrazione cromosomica (CA). L’analisi statistica mediante un test di varianza (ANOVA) ha mostrato un aumento significativo (p < 0.05) nelle frequenze CA per le cellule trattate durante la fase S, ma l’MI non è variata. Le concentrazioni testate non hanno prodotto un aumento significativo della frequenza media di SCE, né hanno modificato la cellula PI nelle fasi G1 e S. Le concentrazioni testate in vivo sono state 0,25, 0,375 e 0,5 mg/kg di peso corporeo. In questo saggio, non sono state osservate alterazioni delle frequenze di CA e IM ai livelli di dose testati. Pertanto, i risultati indicano un effetto clastogenico di 2-CdA nelle colture di linfociti umani.

Parole chiave: linfociti umani, 2-CdA, aberrazioni cromosomiche, SCE, ciclo cellulare.

Introduzione

Gli analoghi purinici sono altamente attivi nel trattamento delle malattie linfoproliferative (Pott-Hoeck e Hiddemann, 1995). La cladribina, 2-clorodeossiadenosina (2-CdA), è un analogo nucleosidico con un atomo di alogeno sostituito in posizione 2 nel suo anello purinico, che conferisce resistenza alla deaminazione da parte dell’adenosina deaminasi (ADA). 2-CdA è un farmaco di scelta nel trattamento della leucemia a cellule capellute, ma è anche altamente efficiente in altre neoplasie linfoidi di basso grado, tra cui la leucemia linfocitica cronica (CLL). I rapporti in letteratura hanno mostrato che 2-CdA dà un tasso di risposta completa (CR) simile e un tasso di risposta globale (OR) simile alla fludarabina, ma l’influenza di entrambi gli agenti sui tassi di sopravvivenza per i pazienti con LLC è ancora incerta. Il tasso di CR indotto da 2-CdA è significativamente più alto rispetto ai pazienti trattati con chemioterapia convenzionale (Robak, 2001). 2-CdA è un altro nuovo analogo delle purine chemioterapiche, con tossicità specifica per i linfociti (Schrimer et al., 1997). La citotossicità si verifica nelle cellule proliferanti e quiescenti, con conseguenti eventi come l’inibizione della sintesi del DNA e delle proteine, nonché l’induzione dell’apoptosi (Robertsson et al., 1993). Nonostante la tossicità, sono stati ottenuti buoni risultati nella risposta terapeutica e questo farmaco è l’opzione principale nel trattamento della tricoleucemia in cui i pazienti mostrano la leucemia a cellule capellute (HCL) (Tallman et al., 1992; Tallman et al., 1993).

I deossinucleosidi dell’adenina inducono apoptosi nei linfociti quiescenti e sono farmaci utili per il trattamento delle malattie linfoproliferative indolenti. Sono stati proposti diversi meccanismi per spiegare la tossicità della deossiadenosina e dei suoi analoghi nelle cellule quiescenti, incluso il legame diretto del dATP al fattore pro-apoptotico Apaf-1 e l’attivazione delle vie caspasi-9 e -3 (Genini et al., 2000).

Un paziente con leucemia mieloide acuta trattato con 2-CdA e Ara-C ha presentato il recupero ritardato del midollo, la sinusite e la sepsi di Candida tropicalis. Ha sviluppato insufficienza multisistemica d’organo ed è morta 1 mese dopo aver iniziato la terapia AML. L’esame post-mortem, limitato al torace e all’addome, ha rivelato candidosi disseminata che coinvolge polmoni, cuore, fegato, reni e milza (Mathew et al., 2000).

Zwaan et al. (2002) ha osservato che i pazienti con t (9:11) sembravano essere significativamente più sensibili rispetto ad altri pazienti con AML ai seguenti farmaci: citarabina (mediana: 2,9 volte), doxorubicina (4,5 volte), mitoxantrone (8,0 volte), 2-clorodeossiadenosina (10,0 volte).

Gli analoghi nucleosidici (NA) come la citosina arabinoside, la fludarabina, la cladribina e la gemcitabina sono componenti essenziali della terapia di induzione della LMA (leucemia mieloide acuta); sono anche efficaci nel trattamento dei disturbi linfoproliferativi e sono stati utilizzati nel trattamento di alcuni tumori solidi. Questi importanti composti condividono alcune caratteristiche comuni, vale a dire in termini di necessità di trasporto da parte di specifici trasportatori di membrana, e metabolismo e interazione con bersagli intracellulari. Tuttavia, differiscono per quanto riguarda i tipi di trasportatori e la loro interazione preferenziale con determinati bersagli che possono spiegare l’efficacia contro i tumori proliferanti rapidi (Galmarini et al., 2001).

Considerando queste informazioni, è importante valutare il potenziale clastogenico di 2-CdA, sulla base di rapporti che questo farmaco induce citotossicità (Tallman et al., 1992; Tallman et al., 1993) e DNA single-strand breaks (Liliemark e Juliusson, 1994). Lo scopo di questo studio era di valutare la capacità di questo agente chemioterapico di indurre danni cromosomici nei linfociti umani e nelle cellule del midollo osseo di topi BALB/C.

Materiali e metodi

Agente chimico

La 2-clorodeossiadenosina antitumorale è stata gentilmente fornita dal Centro Chemioterapico dell’Hospital de Clínicas della Scuola di Medicina di Ribeirão Preto (Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP) per gli esperimenti in vitro e in vivo.

Linfociti del sangue periferico umano

Campioni di sangue sono stati ottenuti da sei volontari sani non fumatori (tre femmine e tre maschi), di età compresa tra 25 e 35 anni e sottoposti a trattamento durante le fasi G1, S e G2 del ciclo cellulare, per l’analisi dell’anomalia cromosomica (CA) e dell’indice mitotico (MI). Inoltre, i linfociti di tre individui (due femmine e due maschi) sono stati utilizzati per l’analisi dello scambio cromatidico sorella (SCE) e dell’indice di proliferazione (PI). I linfociti sono stati coltivati nel mezzo 78% RPMI-1640 (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) integrato con siero di vitello fetale al 20% (Cultilab, Brasile) e aggiunto con penicillina (5 mg/mL) e streptomicina (10 mg/mL). Le cellule sono state stimolate con il 2% di fitoemagglutinina (Life Technologies, Grand Island, NY). Per ogni 5 ml di terreno di coltura è stato aggiunto 1 ml di plasma e le colture sono state incubate a 37 °C per 52 h per l’analisi CA. Le soluzioni 2-CdA sono state diluite in acqua deionizzata alle seguenti concentrazioni: 10, 20 e 40 mg / mL terreno di coltura, secondo Preston et al. (1987). Un controllo negativo è stato incluso in tutti gli esperimenti. La preparazione e la colorazione delle diapositive sono state eseguite con tecniche standard (Moorhead et al., 1960). Le diapositive per l’analisi dello scambio cromatidico sorella (SCE) e dell’indice di proliferazione (PI) sono state ottenute da colture parallele a cui 5-Bromo-2′-deossiuridina (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA; 10 mg / mL) è stato aggiunto in aggiunta a 2-CdA. La colorazione differenziale sorella-cromatidica è stata ottenuta con la tecnica della fluorescenza più Giemsa, utilizzando Hoechst 33258 (Calbiochem – Behring Corp.; 0,05 mg/ml Soluzione di Hank) e 5% Giemsa (Merck). Questo metodo è una modifica di quelli pubblicati da Korenberg e Freedlender (1974) e Perry e Wolff (1974). I vetrini sono stati esposti alla luce bianca durante la notte. I preparati di metafase con 46 ± 1 cromosomi sono stati analizzati in un test cieco. I cromosomi sono stati disegnati schematicamente per il punteggio SCE, così come per l’analisi CA.

protocolli di Trattamento

2-CdA trattamento di colture linfocitarie in base alle diverse fasi del ciclo cellulare

aberrazioni Cromosomiche (CAs)

Dopo sette ore l’avvio della cultura (fase G1), le colture linfocitarie sono stati trattati con 2-CdA per 1 h a 37 °C in cultura, media senza siero. Le cellule sono state fissate 52 h dopo l’inizio della coltura. Dopo il trattamento con 2-CdA, le cellule sono state lavate due volte in mezzo privo di siero e reincubate in mezzo completo. Per il trattamento nella fase S, 24 colture h sono state trattate con 2 CdA per 6 h. Le cellule sono state lavate due volte in mezzo privo di siero, reincubate in mezzo completo e fissate dopo 52 ore di incubazione. Per il trattamento con G2phase, 69 colture h sono state trattate con 2 CdA per 3 h e le cellule sono state fissate dopo 72 h di incubazione. La colchicina (Merck 0,016%) è stata aggiunta 1,5 ore prima della fissazione. Per determinare l’IM, sono state valutate 1000 cellule per coltura e 100 metafasi da ciascuna coltura sono state analizzate per CA, per un totale di 6000 cellule e 600 metafasi, rispettivamente, per ogni trattamento.

Sister chromatid exchanges (SCEs)

Colture linfocitarie provenienti da 4 donatori sani (due femmine e due maschi) sono state trattate con 5-BrdU (10 µg/mL) all’inizio dell’incubazione e quando le cellule hanno raggiunto la fase G1 (7 ore dopo l’inizio della coltura), 2-CdA più 5-BrdU sono stati aggiunti per 1 ora a 37 °C in mezzo di coltura senza siero. Dopo il trattamento, le cellule sono state lavate due volte in mezzo privo di siero, 5-BrdU è stato aggiunto di nuovo e poi le cellule sono state reincubate in mezzo completo. Per il trattamento nella fase S, 24 colture h sono state trattate con 2-CdA più 5-BrdU in mezzo senza siero per 6 h. Dopo il trattamento, le cellule sono state lavate due volte in mezzo senza siero e reincubate in mezzo completo con 5-BrdU. Per l’analisi SCE e PI, le cellule (fasi G1 e S) sono state fissate 72 h dopo l’inizio della coltura. Cinquanta metafasi di seconda divisione per coltura sono state segnate per SCE e cento metafasi di ciascuna coltura sono state segnate per la prima, la seconda e la terza divisione cellulare, per un totale di 200 metafasi e 400 cellule per trattamento, rispettivamente. Il PI è stato ottenuto usando la seguente equazione:

PI =

dove M1 e M3 sono i numeri delle metafasi di prima e terza divisione, rispettivamente (Degrassi et al., 1989).

Animali

Gli animali utilizzati erano topi BALB/c (Mus musculus), ottenuti dalla Casa degli animali della Scuola di Medicina di Ribeirão Preto.

Test in vivo su cellule di midollo osseo di topi Balb/c

I topi del peso di circa 30 g (5-6 settimane) sono stati suddivisi in gruppi di 8 animali (4 maschi e 4 femmine) e trattati mediante iniezione intraperitoneale con 0.5 ml/volume finale di soluzione 2-CdA diluita con acqua distillata alle seguenti concentrazioni: 0,25, 0,375 e 0,5 mg / kg di peso corporeo. Ventidue ore dopo il trattamento (cioè due ore prima del sacrificio), i topi sono stati iniettati con 0,3 mL/volume finale di una soluzione di colchicina all ‘ 1% (Sigma) e uccisi dall’inalazione di etere 2 h più tardi. Il gruppo di controllo negativo ha ricevuto acqua distillata 0,5 mL / volume finale / animale e il gruppo di controllo positivo ha ricevuto ciclofosfamide (CP), 25 mg/kg di peso corporeo. I preparati di midollo osseo per le cellule metafase sono stati ottenuti con la tecnica standard (Ford e Hamerton, 1956). Le diapositive sono state analizzate in un test cieco e 100 metafasi per animale sono state disegnate schematicamente. L’IM è stato ottenuto contando il numero di cellule mitotiche in 1000 cellule analizzate per animale e 100 cellule sono state valutate per CA.

Analisi statistica

L’analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) è stata eseguita sul numero di metafasi anormali e sul numero totale di CA, MI, SCE e PI, con calcoli dei valori P per ciascuna fase del ciclo cellulare. Ogni volta che p < 0.05 è stato trovato, i valori medi di ciascun trattamento sono stati confrontati dal test Student-Newman Keuls. L’analisi statistica è stata effettuata utilizzando i pacchetti software Sigma Stat (Jandel Corporation).

Risultati

Linfociti umani

I linfociti del sangue periferico sono stati trattati con diverse concentrazioni (10, 20 e 40 mg/ml) di 2-CdA nelle fasi G1, S e G2 del ciclo cellulare. Aberrazioni cromosomiche (CA) e indice mitotico (MI) sono stati analizzati in linfociti trattati da sei individui sani (tre femmine e tre maschi) (Tabella 1). Per le cellule trattate durante la fase S, è stato osservato un aumento significativo delle frequenze CA (p < 0,05) a tutte le concentrazioni, rispetto alle frequenze di controllo. I tipi più comuni di aberrazione cromosomica osservati erano lacune cromatidi e isocromatidi (dati non mostrati) e rotture, seguite da doppi minuti, doppi frammenti e singoli frammenti. Per le cellule trattate durante le fasi G1 e G2, le frequenze CA non hanno mostrato alcuna differenza statisticamente significativa tra le colture trattate e i valori di controllo. Sebbene vi sia stata una leggera variazione per l’IM, una differenza statisticamente significativa (p < 0,05) non è stata osservata in nessuno dei trattamenti in relazione agli indici di controllo.

Le frequenze medie dello scambio cromatidico sorella (SCE) e dell’indice di proliferazione (PI) sono state determinate in quattro controlli e in colture linfocitarie trattate con 2-CdA durante le fasi G1 e S in colture raccolte dopo 72 h (Tabella 2). Le concentrazioni testate (10, 20 e 40 mg / mL) non hanno causato alcun aumento significativo della frequenza media delle SCE, né hanno modificato il PI cellulare durante le fasi G1 e S (Tabella 2).

Sistema midollare del topo Balb/c

Le frequenze CA e MI sono state analizzate nelle cellule del midollo osseo di 8 topi Balb/c (4 femmine e 4 maschi) dopo trattamento intraperitoneale con 0,25, 0,37 e 0,50 mg/kg p.c. di 2-CdA (Tabella 3). Nel test in vivo, 2-CdA non ha mostrato effetti citotossici per nessuna delle dosi testate riguardanti le frequenze di CA e i valori di IM, quando tutti i gruppi di trattamento sono stati confrontati. La maggior parte delle aberrazioni erano interruzioni di tipo cromatidico. Nessuna differenza significativa (p < 0,05) è stata trovata né tra gli animali né tra maschi e femmine per i parametri analizzati.

Discussione

Negli ultimi anni, diversi studi hanno dimostrato l’effetto antiproliferativo dei farmaci utilizzati nel trattamento delle neoplasie linfoidi. 2-CdA è un analogo di base impiegato nella chemioterapia per un particolare tipo di leucemia, la leucemia a cellule capellute. Ci sono anche alcuni dati che dimostrano che 2-CdA può essere usato in combinazione con altri farmaci, nel trattamento del linfoma non-Hodgkin di basso grado refrattario e ricorrente (NHL) (Laurencet et al., 1999; Robak et al., 1999). Nel presente lavoro, è stato eseguito uno studio citogenetico in vitro per valutare il potenziale clastogenico di 2-CdA nei linfociti umani per quanto riguarda l’induzione di CA e SCE. Secondo Moore e Bender (1993), i CAS strutturali possono causare la perdita di materiale cromosomico. Il tipo di CA formato dipende dalla natura della lesione indotta nel DNA e dalla fase del ciclo cellulare durante la quale le cellule sono state esposte (Natarajan et al., 1996).

Le colture linfocitarie sono state trattate con tre concentrazioni di 2-CdA (10, 20 e 40 mg/mL) durante diverse fasi del ciclo cellulare. L’effetto clastogenico del farmaco è stato dimostrato dall’aumento significativo (p < 0,05) nelle frequenze CA per tutte le concentrazioni testate durante la fase S del ciclo cellulare. Per il trattamento durante questa fase, 2-CdA è stato lasciato per 6 ore nelle colture. Per gli agenti che agiscono durante una fase specifica del ciclo cellulare, la sequenza di somministrazione può determinare l’efficacia e la tossicità di una terapia di combinazione (Smorenburg et al., 2001).

Questi risultati sono coerenti con quelli riportati da altri autori (Carson et al., 1983), suggerendo che 2-CdA è incorporato nel DNA producendo rotture a singolo filamento (SSBs). Gli SSB possono insorgere sia direttamente, dalla disintegrazione degli zuccheri danneggiati, sia indirettamente, attraverso la scissione enzimatica della spina dorsale del fosfodiestere. Gli SSB diretti derivano principalmente da un attacco di radicali liberi come le specie reattive dell’ossigeno, mentre gli SSB indiretti sono principalmente intermedi normali della riparazione dell’escissione della base del DNA (BER). Gli SSB sono anche le lesioni più comuni indotte da genotossine esogene come radiazioni ionizzanti, agenti alchilanti e il veleno topo1 camptothecin e i suoi derivati antitumorali (Caldecott, 2004).

Alcuni rapporti mostrano che l’analogo di base ha bisogno di un periodo di tempo più lungo per la fosforilazione (Gandhi et al., 1997). Questo meccanismo può spiegare l’aumento della frequenza delle aberrazioni cromosomiche totali durante la fase S del ciclo cellulare. Lo stesso meccanismo si verifica nelle cellule trattate con mitomicina C, un composto S-dipendente, che richiede la replicazione del DNA per convertire i danni al DNA in aberrazioni cromosomiche (Evans e Scott, 1964; Traganos et al., 1980). Altri agenti antitumorali rappresentano lo stesso meccanismo e azione di 2-CdA, come fludarabina e 1-b-D-arabinosilcitosina (ara-C).

Gli analoghi nucleosidici citotossici hanno un ampio uso clinico. Sono stati tra i primi agenti chemioterapici utilizzati nel trattamento di malattie maligne. I nucleosidi antitumorali includono analoghi della pirimidina fisiologica e dei nucleosidi purinici. Questi agenti agiscono come antimetaboliti, competendo con nucleosidi naturali durante la sintesi del DNA o dell’RNA e come inibitori degli enzimi cellulari chiave (Szafraniec et al., 2004), sono S-specifici e devono essere fosforilati per attivare i trifosfati (Plunkett et al., 1980). Durante la fase S del ciclo cellulare, quando il materiale genetico viene duplicato dal macchinario di replicazione del DNA, le cellule sono particolarmente vulnerabili all’insulto genotossico. Mentre i checkpoint G1 e G2 / M arrestano la progressione del ciclo cellulare in punti ben definiti attraverso l’inibizione delle chinasi ciclina-dipendenti, i checkpoint intra-S-fase sono noti per verificarsi in qualsiasi momento all’interno della fase S e coinvolgono più vie di segnalazione (Sidorova e Breeden, 2003; Andreassen et al., 2003)

È molto importante analizzare il meccanismo di risposta del farmaco durante le diverse fasi del ciclo cellulare. L’alto livello di lesione cromosomica può essere dovuto alla citotossicità di 2-CdA causata dalla sua conversione in 2-CdATP, che induce l’inibizione della sintesi del DNA e della riparazione del DNA, coinvolgendo gli enzimi ribonucleotide reduttasi e DNA polimerasi. Questo composto mostra resistenza all’attività dell’adenosina deaminasi (ADA), che è conferita da un atomo di cloro e dalla sostituzione dell’idrogeno in posizione 2 dell’adenosina dell’anello purinico (Baltz e Montello, 1993).

Le SCE sono spesso considerate un parametro per valutare la genotossicità, poiché la loro frequenza è chiaramente aumentata dall’esposizione a molte sostanze chimiche mutagene e cancerogene. Nel presente esperimento, le frequenze di SCE nelle colture trattate con 2-CdA hanno presentato un leggero aumento in relazione alle colture di controllo. L’aumento osservato durante entrambe le fasi non è variato in modo significativo.

Poiché molti farmaci vengono attivati dopo essere stati metabolizzati, sono raccomandati test di mutagenicità in vivo per valutare l’attività clastogenica di quei composti che richiedono l’attivazione metabolica. Tale approccio fornisce anche condizioni simili a quelle riscontrate negli esseri umani (Legator e Ward Jr., 1991). Sebbene vi siano differenze tra roditori e umani, si raccomanda che qualsiasi valutazione si basi su studi sia in vitro che in vivo, e non semplicemente su uno di essi (Huggett et al., 1996).

Nel presente studio, l’effetto clastogenico di 2-CdA è stato analizzato anche in cellule di midollo osseo di topi BALB/c a concentrazioni di 0,25, 0,375 e 0,5 mg/kg di peso corporeo. I risultati hanno mostrato che 2-CdA non era efficiente per indurre aberrazioni cromosomiche. La mancanza di effetto in vivo può essere dovuta alla quantità limitata di 2-CdA disponibile, perché è stata donata in condizioni diluite. Effetti genotossici della gemcitabina analogica di base sono stati riportati in cellule di midollo osseo di topo utilizzando i sistemi di test del micronucleo e dell’aberrazione cromosomica. Aydemir e Bilaloglu (2003) hanno mostrato che la gemcitabina non ha indotto alcuna CAs significativa e non ha causato una riduzione dell’IM di un periodo di trattamento di 6 ore a dosi di 2,0, 4,0 e 8,0 mg / kg di peso corporeo, rispetto al controllo negativo; al contrario, la frequenza di CAs totale è stata significativamente aumentata dalla gemcitabina (p < 0,0001) per un periodo di trattamento di 24 ore con le stesse dosi.

In conclusione, 2-CdA ha mostrato un effetto clastogenico nelle colture linfocitarie umane trattate in vitro durante la fase S del ciclo cellulare, ma non è stato osservato un effetto clastogenico significativo nelle cellule trattate durante le fasi G1 e G2. Nel test in vivo nei topi, 2-CdA non ha mostrato alcun effetto clastogenico ai livelli di dose testati.

Ringraziamenti

Siamo grati al Prof. Dr. A. T. Natarajan, Dr. Elza T. Sakamoto Hojo e il Dr. Lusania G. Antunes per preziosi commenti sul manoscritto e al Sig. Luiz Augusto da Costa Jr., al Sig. Silvio A. dos Santos e alla Sig. ra Sueli A. Neves per preziosa assistenza tecnica. MANTELLE e processo FAPESP n. 99/10643-7 hanno sostenuto questa ricerca. Il Comitato Etico della Ricerca ha approvato il progetto (Processo: CONEP n. 25000.074430 / 2001-88).

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