Chimotripsinogeno A

C. A. S.: 9035-75-0

Reazione enzimatica (l’immagine si aprirà in una nuova finestra)

La chimotripsina è una serina endopeptidasi prodotta dalle cellule acinari del pancreas. La chimotripsina si attiva dopo la proteolisi del chimotripsinogeno da parte della tripsina. Mentre la tripsina idrolizza a lisina e arginina, la chimotripsina scinde selettivamente i legami peptidici formati da residui aromatici (tirosina, fenilalanina e triptofano) (Hedstrom et al. 1992). Due forme predominanti di chimotripsina, A e B, si trovano in quantità uguali nel pancreas bovino. Sono proteine molto simili (80% identiche), ma hanno caratteristiche proteolitiche significativamente diverse (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et al. 1968, e Gráf et al. 2004). Le informazioni di seguito riguardano principalmente la forma A di chimotripsinogeno e chimotripsina.

Storia:

Nei primi anni del 1900, Vernon propose che i preparati pancreatici potessero dare origine ad un attivatore intrinseco dei propri enzimi (Vernon 1901). Gli esperimenti di coagulazione del latte di Vernon determinarono che c’erano almeno due enzimi presenti e che uno era più stabile dell’altro (Vernon 1902). Tuttavia, questa idea non fu ampiamente accettata fino al 1934 quando Kunitz e Northrop confermarono la presenza di un enzima in aggiunta alla tripsina, chiamandola chimotripsina. Sono stati in grado di cristallizzare la chimotripsina, così come il precursore inattivo, il chimotripsinogeno (Kunitz e Northrop 1934). Nel 1938, Kunitz isolò diverse forme attive di chimotripsina, designandole come alfa, beta e gamma (Kunitz 1938).

Nei primi anni 1940 Fruton e Bergmann studiarono ulteriormente la specificità della chimotripsina, riferendo su diversi nuovi substrati (Fruton e Bergmann 1942). Jacobsen identificò presto ulteriori forme di chimotripsina, designandole come delta e pi (Jacobsen 1947). Nel 1948, Schwert ha ulteriormente caratterizzato i pesi molecolari di chimotripsina e chimotripsinogeno.

Nel 1954, la prima evidenza per il meccanismo in tre fasi di chimotripsina idrolizza i substrati di ammide ed estere è stata riportata da Hartley e Kilby, che hanno ipotizzato la presenza di un intermedio dell’enzima acile, che è stato successivamente dimostrato essere vero (Henderson 1970). Nel 1955, Laskowski ottenne un secondo chimotripsinogeno cristallino, chiamandolo chimotripsinogeno B. Nel 1964 Hartley determinò la sequenza aminoacidica della chimotripsina A, che fu successivamente raffinata da Meloun et al. nel 1966. Nel 1968, Smillie et al. determinata la sequenza aminoacidica della chimotripsina B, che ha rivelato l ‘80% dell’identità della sequenza con la chimotripsina A. Durante gli anni ’70 e’ 80 è stata fatta una ricerca per comprendere meglio il meccanismo d’azione e identificare le differenze nelle sequenze aminoacidiche tra tripsina e chimotripsina (Steitz et al. 1969, Cohen et al.1981, Asbóth e Polgár 1983, e Gráf et al. 1988).

Nel 1990, la chimotripsina è stata purificata da altre fonti tra cui il merluzzo atlantico (Ásgeirsson e Bjarnason 1991) e il cammello (Al-Ajlan e Bailey 1997). Sono iniziati anche i lavori per studiare gli inibitori (Baek et al. 1990), e Frigerio et al. chiarito la struttura cristallina della chimotripsina bovina con una risoluzione di 2.0 Å (Frigerio et al. 1992).

Recenti ricerche hanno studiato la piegatura e la denaturazione della chimotripsina su un intervallo di concentrazioni (Ghaouar et al. 2010), interazione di chimotripsina con substrati di nanoparticelle (You et al. 2006, e Jordan et al. 2009) e aumentando la stabilità della chimotripsina coniugando le molecole di PEG (Castellanos et al. 2005, e Rodríguez-Martínez et al. 2009).

Specificità:

La chimotripsina viene attivata attraverso la scissione del legame tra arginina e isoleucina (R15 e I16) dalla tripsina, causando modifiche strutturali e formazione del sito di legame del substrato (Sears 2010). La chimotripsina differisce dalla tripsina in quanto la tripsina scinde i peptidi a residui di arginina e lisina, mentre la chimotripsina preferisce grandi residui idrofobici (Hedstrom et al. 1992). La chimotripsina catalizza preferenzialmente l’idrolisi dei legami peptidici che coinvolgono L-isomeri di tirosina, fenilalanina e triptofano. Agisce anche facilmente su ammidi ed esteri di aminoacidi sensibili. La specificità della chimotripsina per i grandi residui idrofobici può essere spiegata da un legame idrofobo S1 butterato formato da residui da 189 a 195, da 214 a 220 e da 225 a 228 (Cohen et al. 1981).

Sebbene la struttura del sito S1 di tripsina e chimotripsina mostri solo una differenza (alla posizione 189), la mutagenesi diretta al sito di tripsina e chimotripsina non è riuscita a scambiare specificità, suggerendo il meccanismo con cui tripsina e chimotripsina raggiungono la catalisi specifica del substrato non è completamente compresa (Steitz et al. 1969, e Gráf et al. 1988).

Composizione:

I tre residui amminoacidici della triade catalitica (H57, D102 e S195) sono essenziali per la scissione del legame peptidico e sono stabilizzati dai legami idrogeno (Sears 2010 e Gráf et al. 2004). G193 e S195 costituiscono il foro ossianionico e interagiscono con il gruppo carbonilico del legame peptidico scissile, orientandolo per formare l’intermedio tetraedrico (Rühlmann et al. 1973, Huber e Bode 1978, e Gráf et al. 2004).

Caratteristiche molecolari:

La chimotripsina A e B condividono l ‘ 80% dell’identità della sequenza (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et al. 1968, e Gráf et al. 2004). Gli amminoacidi della triade catalitica (H57, D102 e S195) sono altamente conservati nelle sequenze delle peptidasi della famiglia S1 (Gráf et al. 2004). La serina in posizione 214 è anche altamente conservata nella famiglia ed è stata proposta come il quarto membro della triade catalitica (Ohara et al. 1989, e McGrath et al. 1992).

Proteine di Adesione Numero: P00766

CATH Classificazione (v. 3.3.0):

• Classe: Soprattutto Beta
• Architettura: Beta Barile
• Topologia: la Tripsina-come Serina Proteasi

Peso Molecolare:

• 25.6 kDa (Wilcox 1970)

pH Ottimale: 7.8-8.0 (Rick 1974)

Punto Isoelettrico:

• 8.52 (Chymotrypsinogen, Theoretical)
• 8.33 (Chymotrypsin, Theoretical)

Extinction Coefficient:

• 51,840 cm-1 M-1 (Theoretical)
• E1%,280 = 20.19 (Chymotrypsinogen, Theoretical)
• E1%,280 = 20.57 (Chymotrypsin, Theoretical)

Active Site Residues:

• Histidine (H57)
• Aspartate (D102)
• Serine (S195)

Activators:

• Cetyltributylammonium bromide (Spreti et al. 2008)
• Dodecyltrimethylammonium bromide (Abuin et al. 2005)
• Hexadecyltrimethylammonium bromide (Celej et al. 2004)
• Tetrabutylammonium bromide (Spreti et al. 2001)

Inhibitors:

• Hydroxymethylpyrroles (Abell and Nabbs 2001)
• Boronic acids (Smoum et al. 2003)
• Courmarin derivatives (Pochet et al. 2000)
• Peptidyl aldehydes (Lesner et al. 2009)
• Peptides from natural sources (Telang et al. 2009, Roussel et al. 2001, and Chopin et al. 2000)
• Peptides containing an unnatural amino acid (Legowska et al. 2009, and Wysocka et al. 2008)

Applicazioni:

• Analisi di sequenza
• Sintesi del peptide
• Mappatura del peptide
• Peptide fingerprinting