Cistron

Biogenesi di PTX

Le cinque subunità PTX sono codificate da cistroni contigui all’interno di un singolo operone policistronico , la cui espressione è regolata dal sistema BvgA/S. Attraverso questo sistema a due componenti la produzione di tossine può essere modulata dalla presenza di MgSO4 o acido nicotinico, o durante la crescita a basse temperature (per la revisione, vedi ). BvgS è una proteina interna-membrana-spanning che esprime le attività multiple della chinasi. Nello stato attivo, attiva BvgA tramite fosforilazione. La BvgA fosforilata, un regolatore trascrizionale citoplasmatico, si lega quindi ai siti operatori della regione del promotore del gene PTX, dove interagisce con l’RNA polimerasi e attiva la trascrizione. Sebbene siano stati identificati modulatori che interferiscono con la segnalazione BvgS, non è noto alcun ligando BvgS richiesto per attivare la segnalazione, suggerendo che BvgS è attivato per impostazione predefinita .

Dopo la trascrizione, le singole subunità vengono prodotte come preproteine contenenti peptidi di segnale scindibili. Dopo la traslocazione attraverso la membrana interna (molto probabilmente attraverso una via Sec-dipendente), i peptidi del segnale vengono rimossi. Sebbene i peptidi del segnale mostrino le caratteristiche tipiche dei substrati per la peptidasi I del capo, la loro scissione dalla peptidasi I del capo di Escherichia coli è molto inefficiente. La coespressione del gene lep B. pertussis in E. coli aumenta sostanzialmente la maturazione delle subunità PTX . All’interno dello spazio periplasmico, si formano legami disolfuro intra-subunità e l’olotossina viene quindi assemblata prima della secrezione attraverso la membrana esterna. PTX contiene un totale di 11 legami disolfuro intra-subunità, uno in S1, due in ogni S4 e S5 e tre in ogni S2 e S3 . Tutte le cisteine presenti in PTX sono coinvolte nei legami disolfuro intra-catena . La formazione di disolfuro è importante per la biogenesi della tossina, poiché l’alterazione della cisteina in S1 impedisce a questa subunità di assemblarsi con l’oligomero B. La corretta formazione di disolfuro si basa sul sistema DsbA / DsbC, che è stato trovato essenziale per l’assemblaggio e la secrezione di PTX . Tuttavia, le mutazioni in dsbC, che codificano per una delle tre isomerasi disolfuro, non hanno apparentemente alcun effetto sull’assemblaggio della tossina, sebbene compromettano la sua secrezione, suggerendo che DsbC agisce su un componente specificamente richiesto per la secrezione di PTX.

La secrezione non è richiesta per le attività biologiche di PTX, ma l’assemblaggio completo dell’olotossina è importante per una secrezione efficiente, poiché i ceppi progettati per produrre solo S1 o solo l’oligomero B mostrano un difetto nella secrezione . Tuttavia, un oligomero B completamente funzionale può essere secreto in una certa misura in assenza di S1 , indicando che la presenza di S1 non è un requisito assoluto per la secrezione di B oligomero. Al contrario, S1 da solo non può essere secreto in assenza dell’oligomero B, suggerendo che i determinanti della secrezione si trovano all’interno dell’oligomero B, sebbene la presenza di S1 possa certamente migliorare l’efficienza della secrezione. Alcune mutazioni nel gene S1 hanno un forte effetto deleterio sulla secrezione, in particolare nella zona intorno Arg-57 , suggerendo che questa regione di S1 svolge un ruolo nella secrezione di PTX. In assenza dell’oligomero B, S1 molto probabilmente si separa dalla membrana esterna, forse attraverso il suo dominio idrofobo C-terminale. Questo può essere il sito di assemblaggio con l’oligomero B prima della secrezione attraverso la membrana esterna .

Le fasi molecolari nell’assemblaggio delle olotossine sono ancora poco conosciute. Le singole subunità nei ceppi mutanti che non producono le altre subunità vengono rapidamente degradate. Alcune combinazioni di subunità sembrano stabilizzarsi reciprocamente . Ad esempio, la stabilità della subunità S2 è notevolmente migliorata dalla presenza di S4 e viceversa, che è coerente con la formazione di dimeri S2–S4 rivelata dalla struttura cristallina dell’olotossina. È anche possibile che i sottoinsiemi del dimero S2–S4 con la subunità S1 si formino in assenza di S3 e S5. Il dimero S2-S4 non è stato trovato per essere secreto in B. pertosse, mentre l’aggiunta di S1 a questo dimero può provocare un certo livello di secrezione.

Il trasporto di PTX attraverso la membrana esterna di B. pertussis si basa su un sistema di secrezione di tipo IV (T4SS) composto da nove diverse proteine, chiamate PtlA attraverso PtlI . Queste proteine sono omologhe a quelle di T4SSs da altri batteri, tra cui Agrobacterium tumefaciens, Bartonella tribocorum, Brucella suis, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila e Rickettsia prowasekii . I geni ptl si trovano direttamente a valle dei cinque geni PTX strutturali e sono sotto il controllo del promotore ptx . Tuttavia, le proteine Ptl sembrano essere prodotte a livelli inferiori rispetto alle subunità PTX, come evidenziato dalle fusioni traslazionali del gene phoA con vari geni ptx e ptl . La produzione di alcune proteine Ptl sembra essere un passo limitante nella secrezione di PTX. Durante la crescita esponenziale, è stato stimato che i batteri secernono tre molecole di tossina / min / cellula batterica e che le subunità si accumulano all’interno dello spazio periplasmico, sia come subunità individuali che assemblate in olotossine. L’accumulo di subunità si verifica durante la crescita esponenziale anche se i livelli di alcune proteine Ptl aumentano tra 30 e 1.000 molecole per cellula. Pertanto, la secrezione piuttosto che la produzione o l’assemblaggio di tossine possono limitare la velocità. Curiosamente, in assenza delle proteine Ptl, alcune combinazioni di subunità, come il dimero S2–S4 in presenza di S1 , possono essere secrete, sebbene la secrezione dell’olotossina dipenda fortemente dalla presenza delle proteine Ptl.

Si pensa che le proteine Ptl formino un complesso che copre sia le membrane interne che quelle esterne , e tutte (almeno PtlA-H) sembrano essere necessarie per la secrezione di tossine, come investigato da mutazioni in ogni singolo gene ptl . Alcune delle mutazioni introdotte in trans nei ceppi wild-type ptl + hanno determinato un fenotipo di secrezione negativo dominante, confermando che almeno PtlC a PtlH fanno parte di un complesso multimerico. Un passo chiave nella secrezione di PTX è ovviamente la sua capacità di attraversare lo strato di peptidoglicano e PtlE ha dimostrato di esprimere l’attività della peptidogicanasi . Questa proteina lunga 276 residui contiene somiglianze del sito attivo con altre glicoidrolasi e le sostituzioni di alanina in questo sito hanno dimostrato di diminuire notevolmente l’attività della peptidoglicanasi del PtlE ricombinante. Le stesse sostituzioni in PtlE naturale aboliscono anche la secrezione di PTX da B. pertussis, suggerendo fortemente che PtlE è la peptidoglicanasi necessaria per la tossina per attraversare lo strato di peptidoglicano.

Anche la secrezione di PTX richiede molto probabilmente energia. Due delle proteine Ptl, PtlC e PtlH, contengono siti di legame dell’adenosina trifosfato (ATP) e potrebbero quindi fornire l’energia necessaria per la secrezione di tossine. Entrambe le proteine hanno dimostrato di essere necessarie per la secrezione, e in entrambi i casi, i siti di legame ATP putativo sono essenziali per la funzione. Per entrambi, si osserva un fenotipo negativo dominante quando gli alleli mutanti sono coespressi con l’allele wild-type, suggerendo che entrambi funzionano come multimeri o fanno parte del complesso di secrezione. È stato dimostrato che PtlH è associato alla membrana interna e le mutazioni nel sito di legame ATP di PtlH influenzano la sua posizione cellulare e aboliscono le sue interazioni con altre proteine Ptl . Il ruolo preciso di PtlC non è ancora noto. PtlD è anche una proteina di membrana interna e contiene cinque domini transmembrana. È richiesto per la stabilità di PtlE, PtlF e PtlH tramite i suoi residui del C-terminale 72. Tuttavia, questa regione C-terminale non è sufficiente per la secrezione di tossine . PtlF mostra le caratteristiche delle proteine della membrana esterna (OMs), ma può anche essere associato con la membrana interna. In condizioni non riduttive, PtlF e PtlI migrano come un complesso durante l’elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide, indicando che PtlI si lega a PtlF per formazione di legami disolfuro . La corretta formazione del legame disolfuro tra PtlI e PtlF potrebbe dipendere da DsbC, poiché le mutazioni nel gene dsbC influenzano la secrezione senza influenzare l’assemblaggio della tossina .