Citotossicità dipendente dal complemento
Anticorpi terapeutici
Lo sviluppo di anticorpi terapeutici antitumorali comporta l’analisi in vitro delle loro funzioni effettive, inclusa la capacità di innescare CDC per uccidere le cellule bersaglio. L’approccio classico consiste nell’incubare gli anticorpi con le cellule bersaglio e la fonte del complemento (siero). Quindi la morte cellulare viene determinata con diversi approcci:
- Metodo radioattivo: le cellule bersaglio sono etichettate con 51Cr prima del test CDC, il cromo viene rilasciato durante la lisi cellulare e viene misurata la quantità di radioattività.
- Misurazione dell’attività metabolica delle cellule vive (colorazione delle cellule vive): dopo l’incubazione di cellule bersaglio con anticorpi e complemento, viene aggiunto un colorante permeabile alla membrana plasmatica (ad esempio calceina-AM o resazurina). Le cellule vive lo metabolizzano in un prodotto fluorescente impermeabile che può essere rilevato mediante citometria a flusso. Questo prodotto non può essere formato in cellule morte metabolicamente inattive.
- Misurazione dell’attività degli enzimi intracellulari rilasciati: enzima di rilascio delle cellule morte (ad es. LDH o GAPDH) e l’aggiunta del suo substrato porta al cambiamento di colore, che di solito è quantificato come cambiamento di assorbanza o luminiscenza.
- Colorazione delle cellule morte: un colorante (fluorescente) penetra all’interno delle cellule morte attraverso la loro membrana plasmatica danneggiata. Ad esempio, lo ioduro di propidio si lega al DNA delle cellule morte e il segnale fluorescente viene misurato mediante citometria a flusso.
HLA typing and crossmatch testEdit
I test CDC vengono utilizzati per trovare un donatore adatto per il trapianto di organi o midollo osseo, vale a dire donatore con fenotipo corrispondente del sistema di istocompatibilità HLA. All’inizio, la tipizzazione HLA viene eseguita per il paziente e il donatore per determinare i loro fenotipi HLA. Quando viene trovata una coppia potenzialmente adatta, viene eseguito il test di crossmatch per escludere che il paziente produca anticorpi anti-HLA specifici per il donatore, che potrebbero causare il rigetto del trapianto.
La forma CDC di tipizzazione HLA (altre parole tipizzazione sierologica) utilizza un lotto di anticorpi anti-HLA da antisieri allogenici caratterizzati o anticorpi monoclonali. Questi anticorpi vengono incubati uno per uno con i linfociti del paziente o del donatore e la fonte del complemento. Quantità di cellule morte (e quindi risultato positivo) è misurata da morti o cellule vive colorazione. Al giorno d’oggi la tipizzazione CDC viene sostituita dalla tipizzazione molecolare, che può identificare sequenze nucleotidiche di molecole HLA tramite PCR.
Il test CDC viene solitamente utilizzato per eseguire test di crossmatch. La versione base prevede l’incubazione del siero del paziente con i linfociti del donatore e la seconda incubazione dopo l’aggiunta del complemento di coniglio. La presenza di cellule morte (test positivo) significa che il donatore non è adatto a questo particolare paziente. Sono disponibili modifiche per aumentare la sensibilità del test, tra cui l’estensione del tempo di incubazione minimo, l’aggiunta di globulina antiumana (AHG), la rimozione di anticorpi non legati prima di aggiungere complemento, la separazione del sottoinsieme delle cellule T e delle cellule B. Oltre al crossmatch CDC è disponibile il crossmatch citometrico di flusso, che è più sensibile e può rilevare anche gli anticorpi non attivanti del complemento.
