Cloramfenicolo acetiltransferasi come marcatore di selezione per la trasformazione da clamidia
pGFP:: SW2, il vettore shuttle costruito da Wang et al, conteneva un gene β-lattamasi come marcatore di selezione. Inoltre trasporta un gene del GATTO che è fuso al gene di GFP . Abbiamo scoperto che E. coli trasformato con il plasmide pGFP:: SW2 è stato in grado di crescere in mezzo contenente cloramfenicolo (concentrazione finale: 170 µg / ml), suggerendo che il gene del GATTO può anche essere usato come marcatore di selezione per esperimenti di trasformazione da clamidia. Come ammonito da Wang et al., un effetto avverso di cloramfenicolo sui mitocondri ospiti, come dimostrato da Li et al. può influenzare l’utilità di questo antibiotico per la trasformazione da clamidia . In Li et al.secondo il rapporto, la concentrazione tossica minima di cloramfenicolo era di 10 µg / ml, il che ha causato una lieve riduzione del 20% della produzione di ATP. Abbiamo determinato che l’apparente concentrazione più bassa di cloramfenicolo che ha completamente inibito la formazione di inclusione nella C libera da plasmidi. trachomatis L2 ceppo designato L2R era solo 0,05 µg / ml (dati non mostrati), che era molto al di sotto delle concentrazioni tossiche per le cellule ospiti. Pertanto, abbiamo ragionato che questo antibiotico potrebbe essere usato per selezionare i trasformanti che esprimono il GATTO senza stressare significativamente le cellule ospiti.
Abbiamo trasformato L2R con pGFP:: SW2 e selezionato una metà delle cellule trasformate con ampicillina e l’altra metà con cloramfenicolo. Gli antibiotici (2 µg/ml di ampicillina o 0,1 µg/ml di cloramfenicolo) sono stati aggiunti alle colture a 10 h dopo la trasformazione. A partire dal passaggio 2, le loro concentrazioni sono state aumentate a 5 e 0,2 µg / ml, rispettivamente, e sono state aggiunte al momento dell’inoculazione. Il rapporto di divisione tra i passaggi è rimasto 1:1 dal passaggio 1 attraverso il passaggio 4. Anche se il MIC di cloramfenicolo, che è stato determinato a bassa molteplicità di infezione (~0,1 unità di formazione di inclusione per cellula), era 0,05 µg/ml, alcune delle clamidie non trasformate dovevano formare inclusioni in presenza di 0,1 – 0.2 µg / ml l’antibiotico, perché abbiamo usato un alto rapporto EB-cellula per la trasformazione e l’efficacia dell’inibizione della crescita da clamidia da parte degli antibiotici è influenzata dalla molteplicità dell’infezione . Con il protocollo di selezione sopra descritto, in colture selezionate con ampicillina, sotto un microscopio a contrasto di fase, quasi il 100% delle cellule è stato trovato per contenere un’inclusione con RBs aberrante al passaggio iniziale. Le inclusioni aberranti contenenti RB erano ancora presenti in una piccola percentuale di cellule al passaggio 2, ma erano per lo più sostituite da inclusioni apparentemente normali al passaggio 3. Inclusioni normali sono state trovate in circa il 20% delle cellule e inclusioni anormali sono state osservate raramente al passaggio 4. Al passaggio 5, che è risultato dall’inoculazione con il raccolto del 10% dal passaggio 4, sono state trovate inclusioni nelle cellule 80%; apparentemente, nessuna di queste inclusioni conteneva RBS aberranti.
Poiché il cloramfenicolo non causa la formazione di chlamydiae RBs aberrante, abbiamo giudicato la resistenza all’antibiotico in base alla dimensione dell’inclusione. Inclusioni di dimensioni più piccole del normale sono state rilevate in quasi tutte le cellule al passaggio 1. Alcune inclusioni, ma molto piccole, sono state trovate al passaggio 2, e la maggior parte di queste inclusioni sono state sostituite con inclusioni di dimensioni normali dal passaggio 3. Inclusioni di dimensioni normali sono state trovate in oltre il 20% delle cellule al passaggio 4. Al passaggio 5, derivato dopo inoculazione con 10% passaggio 4 raccolto, e un aumento della concentrazione di cloramfenicolo (da 0.2 µg/ml a 0.5 µg/ml), inclusioni di dimensioni normali sono stati trovati in quasi 100% cellule 0000000.
Oltre all’apparente resistenza agli agenti di selezione, abbiamo utilizzato l’espressione GFP e il ripristino della sintesi del glicogeno come marcatori aggiuntivi per una trasformazione di successo . Le EBs raccolte dal passaggio 5 sono state utilizzate per infettare le cellule di McCoy ad un tasso di diluizione 1:100 (equivalenza del numero di cellule) per esperimenti che determinano l’espressione di GFP e la sintesi di glicogeno (Figura 2). Come previsto, né wild-type plasmide-pieno C. trachomatis L2 (434 / bu) (Figura 2A) né untransformed plasmid-free L2R (Figura 2B) espresso GFP. Coerente con i risultati stabiliti che la sintesi di glicogeno in C. trachomatis richiede il suo plasmide, macchia di iodio ha mostrato che il glicogeno è stato accumulato nelle inclusioni di wild-type L2 (Figura 2A), ma non quelli di L2R (Figura 2B). In presenza di 5 µg/ml di ampicillina, che inibisce la divisione RB, L2R non trasformato (Figura 2C) ha formato inclusioni contenenti RBs giganti senza produrre glicogeno; mentre il cloramfenicolo (concentrazione finale: 0,5 µg/ml) ha completamente inibito la formazione di inclusioni visibili nelle cellule infette da L2R (Figura 2D). Coerente con i dati pubblicati da Wang et al. , pGFP::SW2-L2R trasformato selezionato con inclusioni GFP-positive formate da ampicillina con glicogeno (Figura 2E). pGFP:: SW2-trasformato L2R selezionato con cloramfenicolo formato anche inclusioni GFP-positivi contenenti glicogeno (Figura 2F). Come previsto, i trasformanti selezionati per ampicillina sono stati in grado di formare inclusioni contenenti glicogeno di dimensioni normali, GFP-positive in presenza di cloramfenicolo (Figura 2G); allo stesso modo, i trasformanti selezionati per cloramfenicolo erano completamente resistenti all’ampicillina, esprimevano GFP e producevano glicogeno (Figura 2H). Questi risultati suggeriscono che il gene del GATTO nel pGFP::Il plasmide SW2 è funzionale nelle clamidie e la resistenza al cloramfenicolo può essere utilizzata come marcatore di selezione per la trasformazione da clamidia.
Inclusione, espressione di GFP e sintesi del glicogeno di pGFP:: SW2 trasformanti di C . trachomatis L2. Il ceppo 434/bu (A) non trasformato plasmide-pieno, il ceppo L2R non trasformato plasmide-libero (B-D) e L2R trasformato selezionato con ampicillina (E, G) o cloramfenicolo (F, H) sono stati coltivati con mezzo contenente un antibiotico indicato o con mezzo antibiotico-libero. Immagini di inclusioni in colture non colorate e macchiate di iodio sono state acquisite con microscopia a contrasto di fase o microscopia a fluorescenza 48 h post-inoculazione. In tutti i pannelli, il contrasto di fase e le immagini GFP sono sovrapponibili.
Abbiamo poi rimosso il gene β-lattamasi dal pGFP::SW2 plasmide come descritto nella sezione “Metodi”, e utilizzato il risultante pGFP-CAT::SW2 plasmide per trasformare L2R. chlamydiae trasformati sono stati sottoposti a selezione con cloramfenicolo utilizzando lo stesso regime come descritto sopra. Le inclusioni resistenti al cloramfenicolo sono emerse in circa il 20% delle cellule infette nella coltura del passaggio 4. La microscopia a fluorescenza e la macchia di iodio hanno rivelato inclusioni GFP e glicogeno-positive in cellule infettate con EBs raccolte dal passaggio 5 e coltivate in presenza di cloramfenicolo (Figura 3, pannello superiore). Tuttavia, a causa della mancanza di β-lattamasi nel plasmide pGFP-CAT::SW2, i trasformanti non erano in grado di formare inclusioni normali in presenza di ampicillina; invece, le loro inclusioni erano piene di RBs aberranti. Mentre le inclusioni irregolari erano ancora positive per GFP, erano in gran parte prive di glicogeno (Figura 3, pannello inferiore). Dopo il passaggio 5, i trasformanti pGFP-CAT::SW2 sono stati coltivati con cloramfenicolo 0,5 µg / ml per ulteriori quattro passaggi con un rapporto di scissione 1: 100 per ciascun passaggio. Tutte le inclusioni al passaggio 9 avevano lo stesso aspetto delle inclusioni di clamidia piena di plasmidi e non quella del L2R privo di plasmidi, e tutte sono state trovate per esprimere GFP (dati non mostrati). Questi risultati dimostrano che il gene CAT nel plasmide pGFP-CAT::SW2, simile al plasmide pGFP::SW2, funziona come un marcatore di selezione per la trasformazione di C. trachomatis.
Inclusione, espressione di GFP e sintesi del glicogeno in L2R trasformato con pGFP-CAT:: SW2. Le cellule infettate con trasformanti selezionati con cloramfenicolo sono state esposte a cloramfenicolo o ampicillina. Immagini di inclusioni in colture non colorate e macchiate di iodio sono state acquisite con microscopia a contrasto di fase o microscopia a fluorescenza 48 h post-inoculazione. Contrasto di fase e immagini GFP sono sovrapponibili.
Va notato che Tam et al. in precedenza ha tentato di sviluppare un sistema di trasformazione con il gene GATTO come marcatore selettivo . In quello studio, un vettore navetta contenente un gene GATTO è stato elettroporato in EBs di C. trachomatis E (ceppo UW-5 / CX) e L2 (ceppo 434/Bu). Sebbene sia l’mRNA CAT che l’attività enzimatica fossero rilevabili nelle colture iniziali di clamidia trasformata, gli autori non sono riusciti a ottenere trasformanti stabili dopo la selezione con cloramfenicolo per 4 passaggi. È importante notare che entrambi i ceppi elettroporati contengono un plasmide nativo che condivide la stessa origine di replicazione con il plasmide ricombinante utilizzato per la trasformazione . Dal momento che Wang et al. sono stati in grado di ottenere trasformanti resistenti alla penicillina stabili solo da L2R, un C privo di plasmidi. trachomatis variante L2, ma non il wild-type, plasmide-piena 434/Bu, in impostazioni sperimentali altrimenti identici , è retrospettivamente non sorprende che Tam et al. non è riuscito a ricavare chlamydiae resistenti al cloramfenicolo stabile.
