Clothianidin semi-trattamento non ha rilevabile impatto negativo sulle colonie di api e dei loro agenti patogeni

Studio di progettazione

Nel 2013, per un totale di 16 campi (8.9 ± 5.4 ha; media ± s.d.) nel sud della Svezia, previsto per la primavera-seminato la colza (Brassica napus L.) sono stati abbinati in base alla vicinanza geografica (ma separati da >4 km) e di uso del suolo (Fig. 1, vedi sopra). Il paesaggio circostante è stato ispezionato per l’assenza di colture in fiore. Tuttavia, nel 2013, due campi sono rimasti nello studio anche se un altro campo di colza era presente nelle vicinanze, in modo da mantenere il maggior numero possibile di coppie di allevamenti34. In ogni coppia di aziende, un campo è stato assegnato a caso per essere seminato con semi di colza trattati con clothianidin, mentre l’altro campo è stato seminato con semi non trattati con clothianidin (trattati: 8; controllo: 8). Le stesse aziende associate sono state utilizzate nel 2014, ma con i trattamenti invertiti, cioè le località con campi trattati nel 2013 hanno avuto campi di controllo nel 2014 e viceversa (trattati: 6; controllo: 4). A causa della rotazione delle colture, diversi campi all’interno di ogni azienda sono stati utilizzati nel 2013 e nel 2014 (Fig. 1, vedi sopra). Per creare Fig. 1, abbiamo scaricato una mappa dal database World Borders (scaricabile qui: http://thematicmapping.org/downloads/world_borders.php).

Le informazioni sulle variabili del paesaggio circostante per le diverse aziende agricole nel 2014 sono presentate nella tabella supplementare 7. Nel 2014, la metà dei campi focali aveva ulteriori colza seminata a molla (1-13 ha) entro un raggio di 2 km. I semi trattati con clothianidin per i campi focali sono stati rivestiti con Elado, una miscela di due principi attivi: clothianidin (400 g l−1) e β-ciflutrin (+80 g l−1), scelti per questo studio perché costituivano il trattamento insetticida predominante nei semi di colza in Svezia e in altre parti d’Europa63. La clothianidina viene assorbita dalla pianta e distribuita sistemicamente in tutte le sue parti per la protezione contro gli insetti64. la β-ciflutrina non è considerata sistemica e non sono stati rilevati residui nei campioni raccolti in questo studio34. Entrambi i semi trattati con clothianidin e control sono stati rivestiti con il fungicida tiram nel 2013.

Gli agricoltori partecipanti sono stati istruiti a non utilizzare altri neonicotinoidi nei campi durante lo studio, anche se di altro insetticida spray fogliari; principalmente Plenum (pymetrozine), Avaunt/Steward (indoxacarb) e Mavrik (tau-fluvalinate; usato anche come varroacide in apicoltura) sono stati utilizzati per il controllo dei parassiti (Tabella Supplementare 8). Tuttavia, Biscaya, nome commerciale per una formulazione spray contenente il neonicotinoide thiacloprid, è stato applicato a un campo di controllo nel 2013, seguito da uno spray Mavrik 1 settimana dopo, e ad un campo trattato nel 2014, in entrambe le occasioni a 0,3 L ha−1. Il thiacloprid ha una tossicità acuta notevolmente inferiore per le api rispetto al clothianidin65 e solo tracce di thiacloprid sono state rilevate nei campioni di polline, nettare e api nel 2013 e nessuna nel 2014. Mentre Rundlöf et al.34 non ha osservato alcun cambiamento nei risultati quando i campi in cui è stato applicato Biscaya sono stati esclusi dalle analisi, abbiamo rilevato alcuni cambiamenti qualitativi (Tabella supplementare 9). Questi cambiamenti potrebbero essere dovuti ai residui di thiacloprid più elevati rilevati nel 2014, ma potrebbero anche non riguardare Biscaya ma piuttosto la differenza tra Biscaya/Mavrik e le combinazioni di spray insetticidi alternativi utilizzati34 o essere dovuti alla ridotta potenza statistica.

colonie di Api

cento e sedici colonie di api sono stati preparati alla fine di Maggio 2013 da un apicoltore professionista singolo full-size Langstroth orticaria contenente due pettini con principalmente sigillato covata (api), due favi (api), uno tirati fuori vuoto pettine, cinque pettini con la fondazione di cera di api, scosso da due pettini e un 1-year-old (84 sperimentale colonie) o 2-anno-vecchio (12 sperimentale colonie plus 20 riserva colonie), regina di noto discesa per produrre relativamente piccolo, di uguali dimensioni (3418 ± 123 api adulte; media ± s.e.m.; n = 96 colonie) colonie con molto spazio per la crescita che potrebbero diventare abbastanza forti da sopravvivere al prossimo inverno, ma non superare il loro spazio durante l’estate. Sei colonie sperimentali sono state collocate lungo il bordo del campo in ciascuno dei 16 campi di colza (96 colonie in totale)tra il 14 e il 28 giugno 2013 all’inizio della fioritura della colza (Fig. 1). Il lignaggio e l’età della regina erano abbinati tra coppie di fattorie, ma le colonie erano altrimenti distribuite in modo casuale. Le colonie sono state tenute in un campo di colza invernale a gestione biologica di 60 ettari in piena fioritura prima del posizionamento nei 16 campi sperimentali (Fig. 1) per garantire che la crescita delle colonie pre-esperimento si basasse il più possibile sul foraggiamento privo di pesticidi.

Cessata la fioritura della colza nel campo sperimentale, le colonie sono state spostate tra il 2 e il 31 luglio (Fig. 1) ad un apiario comune per svernare. Il 10 agosto, alle colonie è stato somministrato un trattamento al vapore di acido formico contro gli acari Varroa, costituito da 20 ml di acido formico al 60% imbevuto in una spugna domestica piatta posta sotto il coperchio interno sopra i telai. Le colonie sono state alimentate un totale di 20 kg di zucchero per colonia sotto forma di una soluzione di saccarosio 55-60% v/v, fornita in una scatola di alimentazione in tre occasioni durante agosto–settembre 2013. Il 4 dicembre è stato effettuato un ulteriore trattamento con Varroa leggero, spruzzando 30 ml di acido ossalico al 2,6% in saccarosio al 60% tra i telai, direttamente sul grappolo di api. Nella primavera 2014, le colonie sono state spostate in un campo di colza gestito organicamente prima del posizionamento nei campi di colza seminati in primavera 10 (Fig. 1). Le colonie sono state prese in considerazione per l’inclusione nella parte 2014 dello studio se avevano una regina di 2 anni che deponeva le uova nell’aprile 2014 (escluse le colonie che sono morte, ri-regine o avevano regine di 3 anni nell’aprile 2014) e non erano sciamate all’inizio di giugno 2014. Queste restrizioni, oltre al requisito che le colonie sarebbero state esposte/non esposte alla clothianidina per entrambi gli anni dell’esperimento, hanno fatto sì che nel 2014 solo quattro colonie potessero essere assegnate a ciascun campo. Le colonie collocate dai campi trattati nel 2013 sono state nuovamente collocate dai campi trattati nel 2014, in modo da valutare gli effetti cumulativi dell’esposizione pluriennale alla clothianidina, ma sono state altrimenti ri-randomizzate prima del posizionamento per ridurre al minimo i pregiudizi indesiderati. Anche così, due colonie di controllo del 2013 hanno dovuto essere collocate da un campo trattato con clothianidin nel 2014, a causa di insufficienti colonie esposte qualificate per i sei campi trattati con clothianidin. Erano disponibili abbastanza colonie per i quattro campi di controllo. La forza delle colonie è stata equalizzata come descritto per il 2013, ma solo all’interno di ciascun gruppo di trattamento. Le colonie sono state ridotte e pareggiate una seconda volta (8 giugno 2014), dopo che alcune di esse sono diventate troppo grandi e hanno tentato di sciamare (Fig. 1). Ogni colonia ridotta includeva 1 pettine pieno di miele (con le api), 3 pettini con covata principalmente sigillata (con le api) e la regina originale del 2013 e 6 pettini con fondotinta in cera. Le colonie sono state trasferite nei campi di colza primaverili tra il 16 e il 25 giugno 2014 e riportate nel sito comune di svernamento tra il 14 e il 22 luglio 2014 (Fig. 1).

Analisi dei residui

Per confermare l’esposizione alla clothianidina, 24 api adulte per campo catturate all’ingresso dell’alveare, pellet di polline raccolti da 5 api da foraggio nei campi di colza e nettare rimosso dallo stomaco di 5 api da foraggio nettare nei campi di colza sono stati analizzati da ciascun sito per individuare residui di clothianidina. Il polline (> 25 ml) è stato raccolto utilizzando trappole polliniche, che sono state installate per 1 giorno su tre colonie per sito e analizzate per l’origine delle specie vegetali. I campioni sono stati trattati e analizzati come in Rundlöf et al.34 e raccolti durante le valutazioni di fioritura di picco in entrambi gli anni (Fig. 1), con le concentrazioni di clothianidina e di altri quattro neonicotinoidi utilizzati in Svezia (Tabella supplementare 2) quantificate mediante cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) e polline identificato al tipo di colza mediante microscopia ottica e una libreria di riferimento del polline (vedere Tabella supplementare 2 per i limiti di rilevazione e quantificazione). Per ulteriori analisi della variazione dell’esposizione al neonicotinoide delle api da miele in diversi siti, abbiamo raccolto 12 api da miele per sito dall’ingresso dell’alveare. Questo campionamento è stato effettuato in tre siti trattati con clothianidin nel 2013. Il nettare è stato estratto dallo stomaco del miele delle api raccolte. Le concentrazioni di clothianidina sono state successivamente quantificate sia nel nettare che nel tessuto delle api per ogni singolo ape. Ulteriori dettagli sul trattamento del campione per diverse matrici, sul metodo LC-MS/MS e sui controlli di qualità sono forniti in metodi supplementari.

Sviluppo di colonie, re-queening e produzione di miele

Lo sviluppo di colonie di api è stato valutato dallo stesso osservatore addestrato e da un assistente. È stata stabilita la presenza di una regina posatrice, così come la presenza di cellule regina. Se un evento di re-queening era accompagnato da una grande perdita di api adulte, si riteneva che brulicasse. Se non è stata osservata alcuna perdita di api adulte, si è ritenuto che la colonia si fosse ricongiunta attraverso la supersedura. La produzione e lo sviluppo del miele di colonia sono stati determinati pesando le colonie e valutando la forza della colonia utilizzando il metodo Liebefeld66, come il numero totale di api adulte e l’area di covata coperta su tutti i telai. Il numero di api adulte è stato stimato contando le api da miele su entrambi i lati dei 10 fotogrammi. Il numero di cellule di covata coperte (quantità di covata) è stato determinato moltiplicando la proporzione di copertura di covata chiusa per 2700, che è il numero di cellule su un lato dei telai utilizzati. Le colonie sono state pesate durante le valutazioni pre-esposizione e post-esposizione (utilizzando una bilancia da banco Mettler Toledo in grado di pesare fino a 32 kg con 1 g di precisione), per stimare la produzione di miele. I telai pieni di miele sono stati sostituiti da telai vuoti durante la fioritura della colza, per consentire alla colonia di crescere e ridurre lo sciame. Sia i telai pieni che quelli vuoti sono stati pesati, per essere inclusi nel calcolo della produzione di miele. Durante la valutazione post-esposizione, è stato rimosso il maggior numero possibile di telai di miele (max 10% della superficie coperta con covata coperta) per simulare la raccolta del miele degli apicoltori. Le valutazioni pre-esposizione sono state effettuate presso il campo di colza a semina invernale gestito con metodo biologico il 6-17 giugno 2013 e il 9-11 giugno 2014 e le valutazioni post-esposizione presso l’apiario comune svernante dal 29 luglio al 9 agosto 2013 e dal 28 al 31 luglio 2014 (Fig. 1). Inoltre, una valutazione della forza delle colonie primaverili è stata eseguita nell’aprile 2014 stimando il numero totale di api adulte e il numero di covate (Fig. 1). Il valutatore della colonia e gli assistenti sono stati accecati durante la raccolta dei dati rispetto al regime di trattamento dei campi.

Raccolta e lavorazione di campioni di patogeni e parassiti

Campioni di circa 100 api mellifere adulte sono stati prelevati da ciascuna colonia durante le valutazioni pre – e post-esposizione nei campi sperimentali di colza trattati con clothianidin e di controllo sia nel 2013 che nel 2014 (Fig. 1). Le api sono state prelevate dal pettine esterno di ogni colonia e consistevano quindi in una miscela di api domestiche e api foraggere67. Tutti i campioni di api sono stati conservati a -20 °C fino a quando non è stato eseguito il lavoro di laboratorio. Il V. i tassi di infestazione dei distruttori per ogni colonia sono stati determinati lavando i campioni di api adulte con acqua saponata per rimuovere e contare i miti68. Gli addominali di 60 api da miele adulte per colonia (per le singole analisi delle colonie) o per apiario (per le analisi delle colonie raggruppate del 2013, 10 api per colonia) sono stati rimossi e posti in un sacchetto di polietilene con una rete interna (BioReba). Gli addominali sono stati macinati nella sacca usando un pestello e 30 ml di acqua priva di nucleasi (Milli-Q) (0,5 ml per ape) sono stati mescolati accuratamente con il campione per creare una sospensione omogenea. Diverse aliquote da 1 ml di questa sospensione sono state rimosse e congelate immediatamente a -80 ° C per l’estrazione di DNA e RNA e come materiale di riferimento futuro.

Parassiti, agenti patogeni, microbi simbiotici e geni immunitari

I campioni di api raccolti sono stati valutati per una varietà di parassiti e microbi patogeni e non patogeni al fine di studiare il posizionamento di impatto delle colonie nei campi trattati con clothianidin sulla loro prevalenza e abbondanza. Gli organismi includevano l’onnipresente ectoparassita Varroa destructor, 13 virus: acuta ape paralisi virus (ABPV), afide paralisi letale virus (ALPV), Big Sioux River virus (BSRV), black queen cell virus (BQCV), cronica ape paralisi virus (CBPV), deformed wing virus di tipo A (DWV-A), deformed wing virus di tipo B (DWV-B), Israeliano virus della paralisi acuta (IAPV), Kashmir ape virus (KBV), il Lago di Sinai ceppo di virus 1 (LSV-1) e ceppo 2 (LSV-2), Sacbrood virus (SBV), lento ape paralisi virus (SBPV); due comuni honeybee microsporidian intestino parassiti (Nosema apis e Nosema ceranae) e due simbiotica di batteri intestinali (Gammaproteobacterium: Gilliamella apicola e Betaproteobacterium: Alvi). Per i campioni 2013 abbiamo anche analizzato a livello apiario i livelli di mRNA di otto geni delle api (Amel / LRR, Apidaecin, cSP33, Dorsal-1A, Eater-like, NimC2, PGRP-S2 e SPH51) la cui espressione era stata precedentemente collegata all’esposizione di pesticidi,patogeni e/o parassiti19, 44 e immunità (sociale) nelle api miele45.

Estrazione dell’acido nucleico

Il DNA è stato estratto dagli omogenati delle api utilizzando il protocollo per l’estrazione del DNA da Nosema spores69, che è sufficientemente robusto per estrarre anche il DNA da batteri e altri microrganismi. Un totale di 500 µl di omogenato primario di api è stato centrifugato per 5 minuti in una microfuga a 13.000 giri / min. Il pellet è stato ripetutamente congelato-scongelato con azoto liquido e macinato con un micropestle di teflon sterile fino a polverizzato. Il pellet polverizzato è stato risospeso in 400 µl Qiagen tessuti vegetali DNeasy AP1 tampone di lisi contenente 4 µl RNasi-A (10 mg ml-1) e incubato e agitato per 10 min a 65 oC, dopo di che 130 µl P3 tampone di neutralizzazione (3,0 M acetato di potassio pH 5.5) è stato aggiunto, seguito da 5 min di incubazione su ghiaccio e centrifugazione per 5 min a 14.000 giri / min per rimuovere i detriti di lisi. Il DNA è stato purificato da 500 µl del supernatante dal robot di estrazione Qiacube automatizzato Qiagen, seguendo il protocollo DNeasy dell’impianto e eluendo il DNA in acqua priva di nucleasi da 100 µl. L’RNA è stato estratto dal robot Qiacube direttamente dall’omogenato primario di api da 100 µl utilizzando il protocollo Qiagen Plant RNeasy (incluso il trituratore Qia per l’omogeneizzazione aggiuntiva70) e l’RNA è stato eluito in acqua priva di nucleasi da 50 µl. La approssimativo di acido nucleico concentrazione è stata determinata da NanoDrop, dopo che i campioni sono stati diluiti con nuclease-free water uniforme di 10 ng µl−1 (DNA e LSV-1(RNA)) o 20 ng µl−1 (per tutti gli altri campioni di RNA) e conservato a -80 °C.

RT-qPCR e qPCR

I vari microrganismi e host mRNA target sono stati individuati e quantificati da Una Fase di trascrizione inversa-PCR (RT-qPCR) per gli agenti patogeni con un genoma RNA e al sistema immunitario e all’interno di gene di riferimento mRNA target, o mediante PCR quantitativa (qPCR) per gli organismi con un genoma di DNA. I dettagli dei saggi sono riportati nella tabella supplementare 10, nella tabella supplementare 11 e nella tabella supplementare 12. Il primer inverso per Amel / LRR è stato leggermente riprogettato da Di Prisco et al.19 perché l’altissima complementarità tra i primer originali forward e reverse ha portato a livelli elevati di artefatti PCR che dominano il segnale quantitativo. Le reazioni sono state condotte in duplicato, in volumi di reazione da 20 µl (DNA) o 10 µl (RNA) contenenti 2 µl (DNA) o 1,5 µl (RNA), 0,4 µM (DNA) o 0.2 µM (RNA) di primer forward e reverse e la miscela Bio-Rad Eva Green qPCR (DNA) o la miscela Bio-Rad iTaq RT-qPCR One-Step con SYBR Green detection Chemistry (RNA). Le reazioni sono state incubate in piastre qPCR ottiche a 96 pozzetti nel termociclatore Bio-Rad CFX connect, utilizzando i seguenti profili di ciclo di amplificazione: 10 min a 50 °C per la sintesi complementare del DNA (cDNA) (solo RT-qPCR): 5 min a 95 ° C (per inattivare la trascrittasi inversa e attivare la polimerasi Taq) seguiti da 40 cicli di 10 s a 95 °C per la denaturazione e 30 s a 58 °C per la ricottura del primer, l’estensione e la raccolta dei dati. Per i test del DNA sono stati utilizzati i seguenti profili del ciclo di amplificazione: 2 min a 98 °C per la denaturazione iniziale seguiti da 40 cicli di 5 s a 98 °C per la denaturazione e 10 s a 60 °C per la ricottura del primer, l’estensione e la raccolta dei dati. I cicli di amplificazione sono stati seguiti da un’analisi della curva di fusione per determinare la specificità dell’amplificazione leggendo la fluorescenza a incrementi di 0,5 °C da 65 °C a 95 °C. Inclusi su ciascuna piastra di reazione erano controlli di analisi positivi e negativi (non-template). Per ogni tipo di saggio (Tabella supplementare 10, Tabella supplementare 11 e Tabella supplementare 12) è stata preparata una curva di taratura attraverso una serie di diluizioni di 10 volte di un controllo positivo della concentrazione nota che copre 6 ordini di grandezza, per la conversione quantitativa dei dati, stabilendo il profilo della curva di fusione di riferimento dell’amplicone e stimando le statistiche sulle prestazioni della reazione.

Conversione e normalizzazione dei dati

Le curve di fusione delle singole reazioni sono state valutate visivamente al fine di separare le amplificazioni non specifiche, che differiscono nei profili di temperatura di fusione dai veri ampliconi cDNA/DNA target. Amplificazioni non specifiche sono state eliminate dal set di dati. Tutti i saggi sono stati eseguiti in duplice copia, con il valore medio di questi due duplicati utilizzati in ulteriori calcoli. Entrambi i duplicati dovevano produrre un valore quantitativo positivo e passare l’analisi della curva di fusione per i dati da includere nel set di dati. I dati grezzi RT-qPCR di tutte le amplificazioni confermate sono stati successivamente convertiti in numeri di copia stimati di ciascun RNA bersaglio, utilizzando la corrispondente curva di calibrazione per il test. Questi dati sono stati moltiplicati per i vari fattori di diluizione durante tutta la procedura per calcolare le copie stimate di ciascun obiettivo per bee69. Poiché l’RNA è facilmente degradabile, c’è il rischio che le differenze tra i singoli campioni nella qualità dell’RNA (cioè la degradazione) possano influenzare i risultati70. Per correggere ciò, sono stati eseguiti saggi RT-qPCR per l’mRNA di un gene di riferimento interno dell’ape comune (RP49) su tutti i campioni. I dati per gli obiettivi di RNA di interesse sono stati quindi normalizzati al valore medio per l’mRNA RP49, correggendo così i dati per differenze specifiche del campione nella qualità dell’RNA rispetto alle prestazioni RT-qpcr70.

Analisi statistiche

Le proporzioni del polline raccolto dalle api originate da piante di tipo colza sono state confrontate tra trattamenti (trattamento delle sementi di clothianidin/non trattato) utilizzando un modello lineare generalizzato che assumeva la distribuzione binominale e correggeva l’overdispersione. Le concentrazioni di clothianidina nel nettare e nel polline raccolti dalle api e nel tessuto delle api sono state confrontate tra i trattamenti utilizzando test di Wilcoxon-Mann-Whitney. Per confrontare le concentrazioni di clothianidina nel tessuto delle api e il nettare nelle singole api tra i campi, abbiamo usato analisi di varianza (ANOVA), con identità di campo come predittore. Inoltre, le concentrazioni di clothianidina nel tessuto e nel contenuto dello stomaco del nettare delle singole api sono state correlate utilizzando una regressione lineare multipla con identità di campo e concentrazione di clothianidina nel nettare come variabili esplicative e concentrazione di clothianidina nel tessuto delle api come variabile di risposta.

Lo studio ha seguito in generale un progetto di impatto prima-dopo-controllo (BACI), con una struttura di campo accoppiata, ripetuta per due anni consecutivi a livello di colonia per i dati sullo sviluppo delle colonie, nonché sulla prevalenza e l’abbondanza di parassiti, agenti patogeni e batteri intestinali. Gli anni, 2013 e 2014, sono stati analizzati insieme in un unico modello completo, con trattamento delle sementi, fioritura, anno e le loro interazioni come fattori fissi. L’effetto del trattamento con clothianidin è stato valutato dall’interazione tra fioritura e trattamento delle sementi, poiché questo termine riflette la differenza di variazione tra i trattamenti rispetto alla fioritura o alle fioriture di colza. Se l’interazione a tre vie (bloom × seed treatment × year) è stata significativa (cioè se la variabile ha risposto in modo diverso al trattamento con clothianidin da un anno all’altro), il set di dati è stato suddiviso per anno e l’anno è stato eliminato come fattore fisso. Inoltre, il set di dati è stato analizzato per un solo anno se i dati consistevano in una dimensione del campione ≤10 in un anno sia per la prevalenza che per l’abbondanza del microbiota (Tabella supplementare 1). Le colonie che sciamavano (8 nei campi di controllo e 10 nei campi trattati con clothianidin nel 2013; uno in un campo di controllo e due nei campi trattati con clothianidin nel 2014) sono state escluse dall’analisi, poiché lo sciame ha un grande effetto sullo sviluppo delle colonie. È esclusa anche la singola colonia che ha perso la sua regina durante il trasporto prima del posizionamento sul campo nel 2013 (campo trattato). L’esclusione delle colonie che sciamavano dall’analisi ha alterato qualitativamente alcuni risultati (vedi Tabella supplementare 13). I cambiamenti nel livello di significatività potrebbero essere dovuti alla ridotta potenza statistica, alla possibilità casuale o agli effetti biologici.

Sono stati utilizzati modelli lineari a effetti misti (LMM) per testare l’effetto del trattamento con clothianidin sullo sviluppo delle colonie misurato come il numero di cellule covate (quantità di covata) e il numero di api adulte. Il trattamento delle sementi (clothianidin o control), la fioritura (prima o dopo la fioritura della colza), l’anno (2013 o 2014) e le loro interazioni erano fattori fissi. L’identità della coppia agricola, l’identità della fattoria e l’identità della colonia sono stati inclusi come fattori casuali. La produzione di miele è stata confrontata tra i trattamenti utilizzando un LMM con l’identità della coppia agricola e l’identità della fattoria come fattori casuali. I modelli misti lineari generalizzati (GLMMs) sono stati usati per verificare l’influenza del trattamento con clothianidin sul re-queening e sulla mortalità delle colonie con l’identità della fattoria come fattore casuale.

L’influenza del trattamento con clothianidina sullo sviluppo delle colonie primaverili, misurata come numero di api adulte e quantità di covata, è stata testata utilizzando rispettivamente un LMM e un GLMM, con il trattamento delle sementi come fattore fisso e l’identità della coppia agricola e l’identità della fattoria come fattori casuali. Per il numero di cellule di covata capped abbiamo usato una distribuzione di errore binomiale negativo e la funzione di collegamento logaritmica.

I dati del microbioma e dell’acaro di Varroa sono stati analizzati sia sul loro carattere binomiale (presenza/assenza) che quantitativo (abbondanza), utilizzando rispettivamente GLMMs (con distribuzioni di errori binomiali e una funzione di collegamento logit) e LMMs (con distribuzioni di errori normali), con trattamento delle sementi, fioritura, anno e loro interazioni come fattori fissi. Le GLMM sulla prevalenza di microrganismi o acari di Varroa includevano solo l’identità della colonia come fattore casuale, poiché la dimensione effettiva del campione (cioè l’esito meno frequente dei dati di presenza/assenza) non consentiva l’inclusione di più fattori casuali. Solo gli organismi e gli anni con una dimensione del campione (efficace) >10 sono stati analizzati sia per i dati sulla prevalenza che sull’abbondanza. Inoltre, le colonie che non sono risultate almeno una volta positive per un particolare microrganismo sono state escluse dall’analisi dell’abbondanza. Il patogeno delle api e l’abbondanza batterica sono stati trasformati logaritmicamente (log10), poiché sono generalmente distribuiti in modo esponenziale. Gli LMM sull’abbondanza dell’organismo bersaglio contenevano l’identità della coppia agricola, l’identità della fattoria e l’identità della colonia come fattori casuali. Il numero di acari di Varroa per 100 api e il peso della colonia sono stati trasformati a radice quadrata per evitare residui non normalmente distribuiti. Gli intervalli di confidenza sono stati calcolati in base alla probabilità del profilo. Per i dati trasformati a radice quadrata, le stime sono state riconvertite alla scala originale per le illustrazioni grafiche.

I trascritti del gene immunitario erano disponibili solo per il 2013 e a livello apiario, ma hanno anche seguito il design BACI. Gli LMM sull’espressione genica contenevano il trattamento delle sementi e la fioritura come fattori fissi e l’identità della fattoria come fattori casuali.

Le analisi dei dati statistici sono state eseguite utilizzando R ad eccezione delle analisi relative alla verifica dell’esposizione alla clothianidina e dell’uso del suolo, per le quali SAS 9.4 for Windows (SAS Institute Inc.) è stato usato. LMM erano in forma utilizzando la funzione lmer del pacchetto lme4 e GLMM erano in forma utilizzando la funzione glmmTMB del pacchetto glmmTMB in R. I valori P da GLMM sono stati calcolati mediante test del rapporto di verosimiglianza. I valori P degli LMM sono stati calcolati utilizzando la funzione Anova del pacchetto car, per cui sono stati utilizzati test F di tipo III per modelli contenenti interazioni e test F di tipo II per modelli senza interazioni (ad esempio, valutazione della molla e produzione di miele). Gli effetti dei fattori fissi sono stati stimati utilizzando contrasti somma-zero in tutti i modelli ad eccezione di quelli sui residui di neonicotinoidi. I contrasti somma-zero consentono la determinazione degli effetti/interazioni principali (cioè la stima indipendentemente da altre variabili indipendenti) e mostrano gli effetti dei fattori come deviazioni dalla media grande (intercetta). Per i fattori con due livelli, l’entità della deviazione di ciascun livello dalla grande media è la stessa, ma la direzione è diversa. Rappresentiamo effetti di fattori (trattamento delle sementi, fioritura, anno), come la devianza del secondo livello (clothianidin, dopo, 2014) dalla grande media. Questo è stato anche il caso delle interazioni, in modo che ad esempio l’interazione trattamento delle sementi × bloom indica in che misura le colonie esposte alla clothianidina differivano nel cambiamento rispetto alla fioritura della colza dal cambiamento medio di entrambi i trattamenti.

Analisi di potenza

Abbiamo eseguito analisi di potenza per il numero di api adulte e il numero di cellule di covata e la produzione di miele per indagare la dimensione dell’effetto che potremmo potenzialmente rilevare data la nostra progettazione, replica e scelta del modello. La potenza è stata determinata per un intervallo di dimensioni degli effetti a un livello di confidenza nominale di α = 0,05 per 1000 simulazioni Monte Carlo per dimensione dell’effetto utilizzando la funzione powerSim del pacchetto simr. La potenza è stata calcolata per una gamma di dimensioni dell’effetto, espressa come la variazione del numero di api adulte, del numero di cellule di covata ricoperte o della produzione di miele. Dividendo la dimensione dell’effetto con il numero medio di api, il numero medio di cellule di covata o la produzione di miele di tutte le colonie di controllo, abbiamo ottenuto la dimensione dell’effetto espressa come variazione percentuale di tali matrici (Fig. 3). Questa analisi di potenza ha permesso di confrontare la nostra dimensione dell’effetto con la dimensione dell’effetto presentata da Rundlöf et al.34. Utilizzando il modello completo, abbiamo potuto rilevare una dimensione dell’effetto per il numero di api adulte inferiore al 5% con una potenza dell ‘ 80% rispetto alla dimensione dell’effetto inferiore al 20% presentata da Rundlöf et al.34. Ciò è addirittura inferiore ai requisiti di una dimensione dell’effetto <7% stabiliti da EFSA32. Come risultato di una significativa interazione tra trattamento delle sementi, fioritura e anno, il set di dati per il numero di cellule di covata ricoperte è stato analizzato separatamente per ogni anno. Pertanto, presentiamo qui l’analisi della potenza per ogni anno. La dimensione dell’effetto a cui è stato raggiunto l ‘80% è aumentata da sotto il 10% nel 2013 a leggermente al di sotto dell’ 11% nel 2014 (Fig. 3), probabilmente a causa della replica ridotta nel 2014. Abbiamo anche eseguito un’analisi di potenza della produzione di miele (quantità di miele per colonia in kg) utilizzando il set di dati di entrambi gli anni, mostrando che una dimensione dell’effetto inferiore al 20% potrebbe essere rilevata con una potenza dell ‘ 80% (Fig. 3).

Reporting summary

Ulteriori informazioni sulla progettazione sperimentale sono disponibili nel Reporting Summary di Nature Research collegato a questo articolo.