Colony PCR
Colony PCR è un metodo conveniente ad alto throughput per determinare la presenza o l’assenza di DNA di inserimento nei costrutti plasmidici. I singoli trasformanti possono essere lisati in acqua con una breve fase di riscaldamento o aggiunti direttamente alla reazione PCR e lisati durante la fase di riscaldamento iniziale. Questa fase iniziale di riscaldamento provoca il rilascio del DNA plasmidico dalla cellula, quindi può servire come modello per la reazione di amplificazione. I primer progettati per indirizzare specificamente il DNA dell’inserto possono essere utilizzati per determinare se il costrutto contiene il frammento di DNA di interesse. In alternativa, i primer che mirano al DNA vettoriale che fiancheggia l’inserto possono essere utilizzati per determinare se l’inserto ha o meno la dimensione molecolare corretta. I primer specifici dell’inserto possono fornire informazioni sia sulla specificità che sulle dimensioni del DNA dell’inserto, mentre l’uso di primer specifici del vettore consente lo screening di più costrutti contemporaneamente. Colony PCR può anche essere utilizzato per determinare l’orientamento dell’inserto. L’amplificazione PCR del plasmide utilizzando un primer specifico per inserto abbinato a un primer specifico per vettore può essere progettata per produrre un amplicone di una dimensione specifica solo se l’inserto è nel corretto orientamento. In tutti i progetti sperimentali, la presenza o l’assenza di un amplicone PCR e la dimensione del prodotto sono determinati mediante elettroforesi accanto a un marcatore di dimensione del DNA su un gel di agarosio.
