Come progettare gRNA per l’editing del genoma CRISPR?
Il gRNA guida il sistema CRIPR Cas9 nella giusta posizione genomica per eseguire una rottura a doppio filamento.La specificità di targerting del sistema CRISPR Cas9 è determinata dai 20 nucleotidi all’estremità 5 ‘ del gRNA. Le coppie di basi di gRNA al filo complementare della sequenza dell’obiettivo e la nucleasi di Cas9 esegue una doppia rottura del filo.
Durante la progettazione di un gRNA devono essere prese in considerazione le seguenti cose.
1) Contenuto di GC: L’intervallo tipico è compreso tra il 40 % e l ‘ 80%. Un più alto contenuto di GC stabilizza il duplex RNA-DNA mentre destabilizza le ibridazioni off-target
2) Lunghezza: La lunghezza potrebbe essere regolata e variare da 17-24 coppie di basi. Una sequenza più breve porta a ridurre al minimo gli effetti off target. (17 bp è il limite più basso sulla lunghezza della sequenza guida, qualsiasi lunghezza della sequenza guida qualsiasi lunghezza inferiore a 17 ha una possibilità statistica di mirare a loci genomici multipli.)
3) Potenziali effetti off-target: la tolleranza di mismatch e il sito target sono ciò che porta a effetti off-target. Questo può essere ridotto da ricerche effetto obiettivo genome-wideoff.
Ci sono molti siti web che aiutano nella progettazione di gRNAs. Alcuni di loro sono Chop Chop (Harvard), Broad Institute sgRNA designer, e Biotools.
Sto spiegando come utilizzare il sito web Chop Chop qui,
1) vai a https://chopchop.cbu.uib.no/
2) Selezionare specie
3) Selezionare specie specifica gene id o tagliare e incollare il nucleotide di interesse, e iniziare l’analisi.
Una volta eseguita l’analisi, verrà mostrata la rappresentazione grafica del gRNA specifico del sito. Ogni potenziale gRNA mostrerà anche i possibili effetti off target. Selezionare quelli con meno effetti off target.
