Diversità clonale di un tumore del mieloma: da generazioni di cellule alle implicazioni del trattamento
Il concetto di diversità clonale sta diventando ben accettato come un segno distintivo del cancro. Man mano che un tumore cresce e progredisce, il paesaggio genetico della popolazione cellulare può cambiare. Questi cambiamenti sono in gran parte dovuti a errori casuali che si verificano durante ogni divisione cellulare o attraverso eventi mutazionali stimolati da varie esposizioni. Quando uno di questi eventi casuali si verifica nel luogo giusto si tradurrà in un vantaggio di sopravvivenza per tutti i discendenti successivi di quella cellula iniziale. Comprendere le basi della diversità clonale può rivelarsi una parte essenziale del piano di trattamento per i pazienti, contribuendo a guidare la selezione dei farmaci e a determinare la percentuale di cloni che possono essere reattivi/resistenti a trattamenti specifici. Inoltre, molte delle terapie utilizzate per trattare il mieloma probabilmente indurranno mutazioni attraverso i loro meccanismi d’azione o attraverso effetti secondari inaspettati. Comprendere gli effetti delle singole terapie e delle combinazioni specifiche sui tassi di mutazione sottostanti che guidano la diversità di una popolazione tumorale aiuterà a identificare i regimi che aumentano il tasso di mutazione sottostante e mettono il paziente ad un aumentato rischio di sviluppare un clone aggressivo. Questi cambiamenti possono essere identificati dal sequenziamento di prossima generazione della popolazione tumorale bulk rispetto ai cloni a singola cellula che sono stati selezionati da quella popolazione. Al fine di identificare la diversità delle mutazioni presenti nella popolazione tumorale di massa, proponiamo che la clonazione a cellule singole della popolazione genitrice, e quindi il sequenziamento e il confronto tra diversi cloni individuali daranno un’idea migliore della varietà casuale di mutazioni presenti nelle singole cellule che provengono dalla stessa popolazione genitrice.
Per identificare la diversità presente in una popolazione casuale di cellule di mieloma abbiamo selezionato la linea cellulare di mieloma umano KMS-18 come sistema modello. Abbiamo ordinato celle singole dalla popolazione genitore KMS-18 per FACS con i criteri di selezione basati esclusivamente sulle celle singole vitali. Queste cellule ordinate individualmente si sono espanse per un periodo di settimane fino a quando la popolazione era abbastanza grande da essere raccolta per l’analisi (obiettivo circa 5E6 cellule). Quattro di questi cloni a cella singola sono stati selezionati (SCC_04, SCC_10, SCC_16, SCC_18) per l’analisi. Abbiamo preparato intere librerie di genoma e catturato una regione di 3,2 Mb utilizzando il kit di acquisizione Kinome Agilent SureSelect. Le librerie di cattura finali sono state sequenziate sulla piattaforma Illumina MiSeq a una profondità media della regione target di 200X.
I risultati sono stati filtrati per identificare il numero di mutazioni presenti esclusivamente in un subclone rispetto a un altro. Tali eventi o esistevano nella singola cella originale o si sono verificati all’inizio dell’espansione del clone a singola cella. Per limitare l’analisi agli eventi presenti nella singola cella originale o molto presto nel processo di raddoppio abbiamo identificato le varianti che sono state trovate con una frequenza di >20%. Molti di questi eventi erano presenti in più cloni a cella singola che potevano definire la relazione clonale di ciascuna cella originale, tuttavia, il 10% di queste varianti era univoco per un singolo sottoclone. In media abbiamo osservato 1,6 mutazioni per Mb della regione target. Se questo stesso tasso di mutazione è vero in tutto il genoma, ci aspetteremmo di vedere oltre 5000 mutazioni uniche tra due cellule casuali prelevate da un campione di tumore alla rinfusa.
Sono attualmente in corso studi per esaminare la diversità clonale tra generazioni di subcloni. Ulteriori studi sono in corso anche per esaminare i cambiamenti nella diversità clonale tra diversi sottotipi di mieloma, con l’ipotesi che sottotipi più aggressivi come t(4;14) e MAF possano portare a una popolazione clonale più diversificata. Se una popolazione clonale più diversificata si correla con un sottotipo tumorale più aggressivo, questo restituisce il cerchio completo alla questione delle terapie appropriate e se alcune terapie possono effettivamente aumentare la diversità nella popolazione tumorale e provocare una ricaduta più aggressiva della malattia.
Nessun conflitto di interessi rilevante da dichiarare.
