Frontiere in Immunologia

Introduzione

le cellule Dendritiche (DC) sono professionale cellule presentanti l’antigene (Apc), che giocano un ruolo fondamentale nell’induzione e regolazione della risposta immunitaria, tra cui l’induzione di linfociti T citotossici (CTL) risposte. Sono un obiettivo importante per lo sviluppo di vaccini contro i tumori e molti agenti patogeni, tra cui l’HIV e la malaria, in cui sono necessarie risposte CTL per la protezione e l’eradicazione della malattia. DC caricato ex vivo con antigene tumorale (Ag) sono stati somministrati come vaccini a pazienti oncologici per oltre 15 anni. Sono ben tollerati e inducono risposte immunitarie, comprese alcune regressioni cliniche, ma c’è chiaramente spazio per migliorare (1). La rete DC sia nei topi che negli esseri umani è eterogenea, con sottoinsiemi DC specializzati che guidano funzioni immunitarie specifiche (2). Nuovi sviluppi nella nostra comprensione della biologia DC hanno identificato un sottoinsieme di DC caratterizzato dall’espressione di nuovi marcatori CLEC9A (DNGR-1) (3, 4) e XCR1 (5, 6) come importante per l’induzione delle risposte CTL (7). Le strategie vaccinali che forniscono Ag e attivatori direttamente a CLEC9A + XCR1 + DC in vivo promettono di superare molti dei problemi logistici associati ai vaccini derivati in vitro, consentendo precisione e specificità della risposta immunitaria desiderata (8). Qui, discutiamo le proprietà biologiche di CLEC9A + XCR1 + DC che li rendono obiettivi così attraenti per i vaccini CTL e nuovi approcci vaccinali per bersagliarli in vivo.

CLEC9A+XCR1+ DC sono essenziali per l’induzione CTL

La complessità emergente della rete DC e il sottoinsieme ottimale di DC da indirizzare è la prima considerazione importante per la progettazione di nuovi vaccini che mirano a DC in vivo. Nell’uomo e nel topo esistono più sottoinsiemi DC che variano in posizione, fenotipo e funzione specializzata (2). Essi possono essere classificati come (i) infiammatorie monocyte-derivati (Mo) DC che si sviluppano dai monociti e rapidamente sono reclutati ai siti di infiammazione; (ii) plasmacytoid DC (pDC) che sono i maggiori produttori di gli interferoni di tipo I (IFN) in risposta a TLR 7/9 legatura e sono la chiave per l’anti-virale immunità; e (iii) CC convenzionale (cDC), che possono essere ulteriormente suddivisi in base alla posizione in “linfoidi residenti” e “migratori” CC (2). La DC residente linfoide cattura l’Ag direttamente nei tessuti linfoidi, mentre la DC migratrice risiede negli organi periferici (ad es. polmone, pelle e intestino) dove catturano l’Ag quindi migrano verso i tessuti linfoidi per condividere la loro Ag con altri DC residenti linfoidi,o presentano Ag direttamente alle cellule T. In entrambe le posizioni, cDC può essere ulteriormente segregato in sottoinsiemi con funzioni specializzate. Prove crescenti indicano un ruolo per il sottoinsieme CDC del mouse CD11b + nell’induzione delle risposte delle cellule T CD4 + sebbene un ruolo simile per il sottoinsieme CD1c+ DC umano equivalente non sia stato ancora stabilito (2, 9). Tuttavia, è il sottoinsieme definito dall’espressione del recettore tipo C, CLEC9A, e del recettore della chemochina, XCR1, che è cruciale per l’induzione delle risposte CTL contro tumori, virus e altre infezioni patogene (2, 7).

CLEC9A+XCR1+ DC sono stati originariamente identificati nei topi mediante espressione dei marcatori CD8a su DC residente linfoide o CD103 su DC migratoria e sono comunemente indicati come CD8a+ linfoide e CD103+ DC migratoria. Nell’uomo, CLEC9A + XCR1 + DC, comunemente indicato come CD141 + DC, si trovano sia nei tessuti linfoidi che non linfoidi, tra cui pelle, intestino, fegato e polmoni (6, 10-13). CLEC9A e XCR1 sono espressi esclusivamente da questo unico sottoinsieme DC nei tessuti linfoidi e non linfoidi di entrambe le specie, ad eccezione dei bassi livelli di espressione di Clec9A da parte del pDC del topo. Poiché questi marcatori combinati sono attualmente il mezzo più specifico per definire questi DC in entrambe le specie, di seguito ci riferiamo a loro come CLEC9A+XCR1+ DC. Oltre a CLEC9A e XCR1, questi CC condividono l’espressione della proteina nectina-simile, Necl2 (14) e TLR3, e sono i principali produttori di IFN-λ dopo la legatura TLR3 (15). È importante sottolineare che eccellono nella cross-presentation, il meccanismo che consente l’Ag esogeno, come quello catturato da tumori e cellule infette viralmente da elaborare e presentare su MHC I per il riconoscimento da CTLs (16).

Cosa rende CLEC9A + XCR1 + DC così efficace nell’adescamento CTL?

Sebbene altri tipi di cellule, inclusi macrofagi, cellule B e altri sottoinsiemi DC, possano essere presenti in particolari circostanze in vitro (17-20), vi sono prove sostanziali per dimostrare che CLEC9A + XCR1 + DC sono intrinsecamente più efficienti in questo processo in vitro e in vivo (6, 7, 10, 11, 16). I meccanismi molecolari precisi non sono compresi, ma ampi sforzi devono ancora rivelare macchinari specializzati di presentazione incrociata unici per CLEC9A+XCR1+ DC (16). Tuttavia, ci sono diverse caratteristiche di questi DC che spiegano collettivamente la loro capacità di cross-adescamento superiore nonostante una capacità di assorbimento Ag simile rispetto ad altri sottoinsiemi DC. In primo luogo, CLEC9A+XCR1+ DC mantengono un pH meno acido negli endosomi e nei fagosomi, favorendo la presentazione incrociata dalle vescicole endocitiche precoci (21) e facilitando la presentazione incrociata di Ag mirata agli endosomi/lisosomi tardivi (20, 22). In secondo luogo, CLEC9A+XCR1+ DC sono più efficienti nella traslocazione di Ag da endosomi/fagosomi nel citosol per l’accesso alla classica via di elaborazione MHC I (23). In terzo luogo, CLEC9A, un recettore per i filamenti di actina esposti su cellule morte, svolge un ruolo chiave nel fornire Ag catturato da cellule morte per il cross-adescamento (24-27). In quarto luogo, CLEC9A+ XCR1 + DC espresso alti livelli di TLR3, un enhancer noto di cross-adescamento (28). Infine, l’attivazione costitutiva del sensore di risposta della proteina dispiegata ,RE-1α, e il fattore di trascrizione XBP-1 è stato recentemente dimostrato di regolare la presentazione incrociata in modo specifico da CLEC9A+XCR1+ DC (29). Vi è anche evidenza che XCR1 e Necl2 sono coinvolti nell’attivazione CTL, sebbene non direttamente attraverso l’aumento del percorso di presentazione incrociata (5, 6, 14). Queste caratteristiche forniscono una forte motivazione per sviluppare tecnologie che forniscono specificamente Ag al percorso di presentazione incrociata di CLEC9A + XCR1 + DC in vivo.

Targeting CLEC9A+XCR1+DC in vivo

Gli anticorpi (Ab) specifici per i recettori di superficie DC, in particolare i recettori di assorbimento Ag, possono essere sfruttati per fornire Ag direttamente a DC in vivo (30). La scelta del recettore dipende dalla sua specificità per il sottoinsieme DC da indirizzare oltre al percorso di elaborazione e presentazione AG utilizzato dal recettore dopo l’internalizzazione. Una varietà di recettori di lectina di tipo C (CLR) sono stati sfruttati per questo scopo, e questo è rivisto altrove (1, 30) ma per la consegna di Ag a CLEC9A+XCR1+ DC nei topi, DEC-205 è stato un obiettivo importante. La consegna di Ag via DEC-205 Ab induce sia le risposte delle cellule T CD4+ che CD8+ in presenza di adiuvante ed è superiore ai vaccini DC caricati ex vivo per prevenire la crescita tumorale . Gli studi clinici di fase I / II che mirano a NY-ESO-1 Ag per il trattamento di tumori maligni solidi multipli che esprimono questo Ag sono in corso utilizzando CDX-1401, un Ab completamente umanizzato contro DEC-205 (CellDex Therapeutics). Nell’uomo, DEC-205 è ampiamente espresso su tutti i DC, oltre alle cellule B, alle cellule T e alle cellule NK. Sebbene CLEC9A + XCR1 + DC, CD1c + DC, pDC e MoDC abbiano dimostrato di elaborare e presentare Ag consegnato da DEC-205 alle cellule T CD4+ e CD8+ in vitro (20, 31-33), confronti diretti limitati suggeriscono che CLEC9A+ XCR1+ DC sia più efficace alla presentazione incrociata (20). Ciò è probabilmente dovuto al traffico preferenziale di DEC-205 agli endosomi tardivi, che in genere favorisce l’elaborazione AG tramite il percorso MHC II (34), pur consentendo la presentazione incrociata di CLEC9A+XCR1+ DC (20).

Un approccio interessante consiste nel fornire più specificamente Ag a CLEC9A+XCR1+ DC utilizzando Ab o ligandi specifici per CLEC9A (3, 4) o XCR1 (35). Gli studi che utilizzano Clec9A per la consegna dell’ag in topi osservano le risposte efficaci delle cellule di T di CD8+ e, sorprendentemente, l’immunità superiore delle cellule di T di CD4 + una volta confrontata direttamente a DEC-205, anche in assenza di adiuvante (3, 4, 36). Le ragioni principali per l’efficacia del targeting di Clec9A includono il suo traffico intracellulare, poiché Clec9A fornisce Ag agli endosomi precoci e di riciclaggio (27) e la persistenza di anti-Clec9A Ab nel siero, con conseguente presentazione prolungata di Ag (36). Determinare le interazioni molecolari di CLEC9A dopo l’internalizzazione e come questo influenza il traffico e l’elaborazione di Ag, farà indubbiamente luce sulla base dell’efficacia di targeting di Clec9A.

Anti-human CLEC9A Ab può fornire Ag a human CLEC9A+XCR1+ DC per l’elaborazione e la presentazione su linee cellulari T CD4+ e CD8+ in vitro (37). Ciò fornisce la prova di principio e una forte motivazione per sviluppare ulteriormente CLEC9A Ab anti-umano per i vaccini e confrontare in modo più completo con DEC-205 Ab e altri approcci che mirano a più sottoinsiemi DC. Tali studi sono stati limitati a causa delle difficoltà nell’ottenere un numero sufficiente di CLEC9A+ XCR1 + DC umano per un’analisi funzionale dettagliata, ma sono ora fattibili con lo sviluppo di nuovi modelli murini umanizzati, in cui CLEC9A+XCR1+ DC umano funzionale si sviluppano e possono essere mirati con CLEC9A o DEC-205 Abs in vivo (38).

Adiuvanti per l’attivazione di CLEC9A+XCR1+DC

I primi studi clinici in DC e gli studi su topi che indagano Clec9A o DEC-205 targeting Ab hanno chiaramente dimostrato un requisito per l’attivazione DC al fine di indurre risposte CTL ottimali (31, 39). I ligandi TLR sono alcuni degli adiuvanti più promettenti attualmente in fase di valutazione in clinica e l’espressione differenziale di TLR da sottoinsiemi DC potrebbe influenzare profondamente la scelta dell’adiuvante. Questa è una considerazione particolarmente importante per la valutazione preclinica dei vaccini che mirano a CLEC9A + XCR1 + DC poiché l’espressione TLR varia nei sottoinsiemi DC di topi e umani. Il ligando TLR9, CpG, è stato ampiamente utilizzato come adiuvante nei topi, incluso con Clec9A Ab (36) ed è stato valutato clinicamente, con effetti avversi limitati, come adiuvante nella chemioterapia oncologica e nei vaccini DC ex vivo (40). Mentre TLR9 è ampiamente espresso nei topi, incluso da CLEC9A + XCR1 + DC, negli esseri umani è limitato a pDCs (39). Tuttavia, l’attivazione del pDC umano da parte del CpG induce grandi quantità di IFN di tipo I che potrebbero potenzialmente svolgere un’importante funzione di spettatore per l’attivazione di CLEC9A+XCR1+ DC e la successiva induzione di risposte antitumorali (41, 42). In contrasto con le loro controparti del mouse, anche CLEC9A+XCR1+ DC umani mancano di espressione di TLR4 ma esprimono TLR8, che non è funzionale nei topi (39).

Un ligando TLR7/8, R848 o resiquimod, è stato approvato dalla FDA per uso topico ed è attualmente in fase di studi clinici con DEC-205 (CDX-1401, CellDex) (43). Attiva anche CD1c + DC tramite TLR8 e pDC tramite TLR7. Il suo potenziale per essere utilizzato nei vaccini rimane da determinare, con studi murini che indicano che la sua breve emivita e la sua formulazione potrebbero non essere ideali per attivare la DC localmente per avviare risposte immunitarie adattive, ed è stato implicato in gravi effetti collaterali osservati negli studi clinici (43).

Il ligando TLR3, polyI:C, sta emergendo come un attraente adiuvante da combinare con il targeting DC Ab, poiché l’espressione TLR3 è conservata tra CLEC9A+XCR1+ DC umano e topo. PoliI:C è risultato essere l’adiuvante ottimale da utilizzare in combinazione con DEC-205 targeting Ab nei topi (44). I derivati poli I: C Hiltonol e Ampligen sono ben tollerati negli esseri umani e inducono una risposta IFN di tipo I che imita quella di un’infezione virale (45). Questi sono ora in fase di valutazione in studi clinici in combinazione con DEC-205 targeting Ab (CellDex Therapeutics; NCT00948961).

Conclusione

Rimane un grande bisogno per lo sviluppo di vaccini che suscitino risposte CTL antivirali e antitumorali efficaci. La scoperta del CLEC9A+XCR1 + DC nei topi e negli esseri umani, come sottoinsieme specializzato per la presentazione incrociata AG e il CTL cross-priming, ha rivelato nuove promettenti strade per la progettazione di vaccini. Tuttavia, il contributo di altri sottoinsiemi DC all’efficacia di questo processo deve ancora essere determinato. Pertanto, le domande rimangono: è più efficace consegnare Ag al CLEC9A+XCR1 + DC che sono meglio equipaggiati per la presentazione incrociata, o la co-consegna ad altri sottoinsiemi DC fornirà aiuto? Quali recettori consegneranno meglio l’Ag ai compartimenti intracellulari richiesti e quali adiuvanti miglioreranno le risposte immunitarie? Gli studi fino ad oggi suggeriscono che il targeting CLEC9A+XCR1+ DC in vivo, insieme agli adiuvanti per attivare specificamente questi DC, offre grandi promesse. L’avanzamento dei modelli di mouse umanizzati che consentono lo sviluppo di CLEC9A+ XCR1 + DC e di altri sottoinsiemi DC, consentirà di rispondere a queste e ad altre domande e faciliterà la traduzione da banco a letto.

Dichiarazione sul conflitto di interessi

Mireille H. Lahoud e Kirsteen M. Tullett è elencato come inventori sulle domande di brevetto relative a Clec9A. Kristen J. Radford non ha conflitti di interesse da segnalare.

Riconoscimenti

Mireille H. Lahoud e Kristen J. Radford sono supportati da sovvenzioni di progetto dal National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC 604306 e 1025201) e dalla Prostate Cancer Foundation of Australia (PG2110). Kristen J. Radford detiene una borsa di studio NHMRC CDF livello 2. Kirsteen M. Tullett è il destinatario di una borsa di studio internazionale di dottorato dell’Università del Queensland. Questo lavoro è stato reso possibile attraverso il supporto delle infrastrutture operative del governo dello Stato vittoriano e il governo australiano NHMRC Independent Research Institute Infrastructure Support Scheme.