Gap junction protein Connessina 43 è diretto regolatore trascrizionale di N-caderina in vivo

la manipolazione degli Embrioni

Adulti X. laevis sono stati mantenuti a temperatura di 17 °C e utilizzato secondo le norme del Biologico Unità di Servizio presso l’University College di Londra, in conformità con l’UK Home Office linee guida stabilite Animali Act del 1986, come described45. Gli embrioni di X. laevis sono stati ottenuti e messi in scena come precedentemente descritto46, 47. Per colpire specificamente la cresta neurale, gli embrioni sono stati iniettati nei blastomeri ventrali animali allo stadio di otto cellule su un lato per tutti gli esperimenti, tranne quando sono stati utilizzati lisati embrionali. In questo caso gli embrioni sono stati iniettati in entrambi i lati animali di embrioni a due stadi cellulari. Microiniezioni embrionali sono state eseguite secondo48. Se necessario, fluoresceina-destrano (FDx; Invitrogen, D1821, 20 ng) o rodamina-destrano (RDx; Invitrogen, D1824, 20 ng) sono stati usati come traccianti. Oligomorfolini contro X. laevis Cx43 (Cx43MO1; 8-24 ng, 5 ‘- TTCCTAAGGCACTCCAGTCACCCAT-3’, Cx43MO2; 8-24 ng, 5 ‘- AAAAATGGTTTTCTTGTGGGTCGA-3′) e BTF3 (BTF3MO, 40 ng, 5′ – AACGGGGGTTTAAAGGCTTCCT-3′) sono stati sintetizzati e forniti da Gene Tools LLC. Sono state utilizzate concentrazioni equimolari di morfolino di controllo standard (CTLMO: 3′-ATATTTAACATTGACTCCATTCTCC-5’). Le quantità di morfolini corrispondono alle quantità iniettate in un lato degli embrioni a otto stadi cellulari, mentre l’altro lato è stato utilizzato come controllo interno. Quando gli embrioni sono stati utilizzati per la raccolta di lisati embrionali, sono stati iniettati allo stadio a due cellule in entrambi i blastomeri animali e sono stati utilizzati il doppio dei dosaggi menzionati. Per testare l’efficienza di Cx43MOs sull’mRNA cx43 endogeno, abbiamo eseguito l’analisi western blot. Entrambi i Cx43MOs hanno abbassato in modo efficiente i livelli proteici del Cx43FL endogeno e del Cx43iso (Fig. 3 bis, lettera b). Al fine di convalidare l’efficienza di BTF3MO, abbiamo testato immunotaining delle cellule della cresta neurale l’espressione della proteina BTF3, che ha mostrato una diminuzione dei livelli di BTF3 nelle cellule BTF3MO rispetto a CTLMO (Fig. 3 bis).

L’ibridazione in situ è stata eseguita come precedentemente descritto49, 50. In breve, gli embrioni sono stati fissati in MEMPFA, seguiti da ibridazione notturna con sonde marcate con digoxigenina, incubate con un anticorpo AP e l’attività AP è stata sviluppata utilizzando substrati NBT/BCP. Le sonde a RNA marcate con digoxigenina sono state preparate per foxD348 snail251, twist52, n-cadherin53, C353, btf3 (Xenbase: XL075i22) e sox1054, sox954. C3 (1 µg / ml), snail2 (0,8 µg/ml), foxD3 (2 µg/ml), sox10 (1 µg/ml), sox9 (1 µg/ml) e twist (0,7 µg/ml) sono stati utilizzati per valutare l’induzione della cresta neurale, twist (0.7 µg/ml) per la migrazione della cresta neurale, n-caderina (1 µg/mL) per valutare i livelli di espressione e modello di espressione btf3 (0,7 µg/mL). L’immunotenente a monte intero è stato eseguito come precedentemente descritto55 utilizzando l’anticorpo Cx43 (1: 1000, Sigma, C6219). In breve, gli embrioni sono stati fissati in MEPMFA e incubati durante la notte con l’anticorpo alla diluizione descritta.

Gli espianti di cap animali sono stati sezionati da Xenopus blastulas (stadio 8) utilizzando una tecnica standard48,56 e preparati per l’ibridazione in situ come descritto sopra. Per i test cap animali, 500 pg mRNA sono stati iniettati nel lato animale dei due blastomeri di embrioni a due stadi cellulari. L’analisi di ISH è stata eseguita su 20-25 embrioni per condizione per ogni esperimento indipendente.

Manipolazione e imaging della cresta neurale

I trapianti di cresta neurale sono stati effettuati come precedentemente segnalato57. In breve, la cresta neurale prelevata dallo stadio 18 embrioni etichettati con fluorescenza è stata sezionata con coltelli per sopracciglia e innestata in embrioni ospiti non etichettati. Per esperimenti in vitro, gli espianti di cresta neurale cranica sono stati sezionati allo stadio 18 utilizzando una tecnica standard58,59 e placcati su piatti rivestiti di fibronectina (Sigma, F1141) come precedentemente descritto53. Per i test a cellule singole, le cellule della cresta neurale sono state brevemente dissociate in Danilchick medium53 privo di Ca2+/Mg2+. Per ogni condizione, dieci embrioni trapiantati con NC etichettato fluorescente sono stati analizzati per esperimento.

L’immunotenente è stata eseguita su espianti di cresta neurale come precedentemente descritto54 utilizzando anti-N-caderina (1:50, rat IgG, clone MNCD2, DSHB), anti-E-caderina (1:250, mouse IgG, clone 5D3, DSHB), anti-BTF3 (1:100, Abcam, ab107213), anti-rabbit IgG Alexa488 (1:500, Invitrogen, A11034) and anti-rat IgG Alexa488 (1:500, LifeTechnologies). When required, 4′,6- diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1 μg/mL, Sigma, D9542) and/or phalloidin tetramethylrhodamin-b-isothiocyanate (PhR; 1 μg/mL, Sigma, P1951) were used.

Imaging of fixed embryos was performed using a MZFLIII Leica fluorescence stereomicroscope equipped with a DFC420 Leica camera controlled by Leica IM50 software. L’imaging della migrazione della cresta neurale in vitro è stato eseguito utilizzando la cinematografia time-lapse come descritto in precedenza53, 60. In breve, le cellule della cresta neurale sono state coltivate in piastre di petri di plastica o di vetro rivestite con fibronectina e la microcopia time-lapse è stata avviata dopo un’ora di coltura in vitro. Per la motilità cellulare e la migrazione, sono stati utilizzati microscopi composti (un microscopio Nikon Eclipse 80i con una fotocamera digitale Hamamatsu o un microscopio DMRXA2 Leica con una fotocamera digitale Hamamatsu controllata da un semplice programma PCI) dotati di stadi motorizzati e una lente a secco 10×/0,30 NA. Le colture NC sono state preparate come descritto sopra. Le immagini sono state acquisite ogni 5 minuti per un periodo di 12 ore. Per l’imaging della morfologia cellulare, è stato utilizzato un microscopio TCS SP8 con lenti obiettivo ad immersione in acqua 63 × /0,90 NA e controllato dal software LAS–AF. Le celle fisse sono state riprese utilizzando un obiettivo ad immersione in olio 63 × /1,4 NA e un microscopio confocale Leica TCS SPE controllato dal software LAS-AF.

Per la localizzazione dei costrutti o i livelli IF endogeni, sono stati analizzati 10-15 NCC per ogni condizione per esperimento.

Migrazione cellulare e analisi della morfologia cellulare

Il test di chemiotassi è stato eseguito seguendo una procedura standard61 utilizzando perline acriliche di eparina (Sigma, H5263) rivestite con 1 µg/mL di fattore derivato cellulare stromale umano purificato-1 (Sigma, SRP3276). La motilità cellulare e la chemiotassi sono state analizzate utilizzando strumenti di analisi ImageJ (https://imagej.nih.gov), come descritto in precedenza53, 60. In breve, ogni singola cella è stata tracciata manualmente utilizzando il plugin di tracciamento manuale di ImageJ, i dati sono stati raccolti e analizzati utilizzando il plugin Chemiotaxis di ImageJ. La morfologia cellulare è stata valutata implementando l’indice di circolarità (cerchio completo = 1) e stimata dagli strumenti di analisi ImageJ. La dispersione cellulare è stata analizzata utilizzando l’algoritmo di triangolazione Delaunay (plugins ImageJ) ed è stata tracciata come area triangolare di espianto media, come descritto prima54. L’area protrusiva delle cellule è stata analizzata in cellule di cresta neurale sul bordo di un espianto che misura l’area in eccesso che deriva da due tempi consecutivi con intervallo di tempo di 4 minuti; questi due fotogrammi consecutivi sono stati sottratti per generare la nuova area12. Per l’analisi della chemiotassi cellulare e della dispersione cellulare sono stati analizzati 10-15 espianti per condizione per ogni esperimento indipendente. Per la motilità cellulare, la morfologia cellulare e le protrusioni cellulari sono stati analizzati 15-25 NCC per condizione per esperimento.

Biologia molecolare, plasmidi e reagenti

Per la sintesi di cDNA, l’RNA totale è stato isolato da 10-15 embrioni stadi 23-24 o 10-15 caps animali stadio 8 da X. laevis per condizione per ogni esperimento indipendente e tre repliche tecniche sono state utilizzate all’interno di ciascun sperimentato25. Quantitative PCR (qPCR) was performed on an Applied Biosystems ABI 7900HT machine using the Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, 4385612) and the following primers: ef-1 forward 5′- ACCCTCCTCTTGGTCGTTT-3′, ef-1 reverse 5′-TTTGGTTTTCGCTGCTTTCT-3′15, ncad forward 5′-CAGGGACCAGTTGAAGCACT-3′, ncad reverse 5′-TGCCGTGGCCTTAAAGTTAT-3′62. n-cad mRNA expression was plotted as relative expression normalized against the housekeeping gene ef-1.

Plasmids: Cx43 constructs were synthesized using the X. laevis Cx43 sequence from cDNA clone (UniGene ID XL.1109) come modello. Cx43 (Cx43FL, aa 1-379), Cx43 carbossi terminally truncated construct (Cx43Trunc, aa 1-212) e Cx43-20k construct (Cx43Tail, aa 213-379) sono stati clonati in 5’BamHI/3’XhoI di vettori pCS2+ o pCS2-EGFP. Il vettore pCS2-EGFP è stato gentilmente fornito dal Dr. Masa Tada. Il costrutto inducibile di Cx43Tail è stato preparato fondendo il Cx43-20kTail (aa 219-379) al dominio legante del GR umano (aa 512-777). Cx43-20k è stato clonato in 5 ‘ Ecori/3’SacI e GR in 5’SacI/3’XhoI di pCS2+ e pCS2-EGFP. I costrutti BTF3 sono stati sintetizzati usando la X. sequenza di laevis dal clone di cDNA (UniGene ID XL.3536). BTF3FL (aa 1-162) è stato clonato in 5 ‘ Ecori/3’XhoI di pCS2+ o pCS2-EGFP. Il costrutto di cancellazione BTF3 privo della regione NLS RRKKK (BTF3-dNLS, aa 1-158) è stato clonato in 5’BamHI/3’ClaI di pCS2+. Per gli esperimenti BiFC (Fig. 4b, c), Cx43Tail e Cx43Trunc sono stati clonati in 5 Bamhi/3 Bamhi di pCS2-VC155. BTF3FL è stato clonato in 5 Bamhi/3 Bamhi di pCS2-VN9m. I vettori BiFC sono stati gentilmente forniti dal prof James C. Smith. Tutte le sequenze di costrutti sono verificate mediante sequenziamento automatico del DNA (Source Biosciences, UK). When required, plasmids were linearized and mRNA transcribed as described before25, using sp6MessageMachine (Ambion). The mRNA constructs injected were: membrane GFP (mGFP, 300 pg), membraneRFP (mRFP, 300 pg) nuclearRFP (nRFP, 300 pg), lifeactin-GFP (400 pg), N-cadherin-GFP (500 pg), Cx43FL (500 pg), Cx43Trunc (500 pg), Cx43-20k (500 pg), BTF3FL (500 pg), BTF3-dNLS (500 pg), Cx43-20k-VC (500 pg), Cx43Trunc-VC (500 pg), and BTF3-VN9m (500 pg). The following plasmids were injected as DNA: pcDNA3.2-Cx43-HA (800 pg/embryo,22); pcDNA3.2-Cx43-ML-HA (800 pg/embryo;22); ΔΜ213 Cx43 (800 pg/embrione,63).

Tutte le analisi sui costrutti fluorescenti sono state valutate normalizzando la fluorescenza di fondo e, quando richiesto, la fluorescenza totale dell’area cellulare.

Sono stati utilizzati i seguenti reagenti: flufenamic acido (50 µM per NC espianto di incubazione −100µM per embrione di trattamento, Sigma, F9005), meclofenamic acido (50 µM per NC espianto di incubazione −100µM per embrione di trattamento, Sigma, M4531), actinomicina D (20 µM, Sigma, A1410), CHX (10 µM, Sigma, C7698) e l’etanolo disciolto desametasone (10 µM) è stato aggiunto al mezzo di coltura, in una fase 14-15 e mantenuto fino alla cresta neurale migratori fasi embrionali (fase 23). Per controllare la possibile fuoriuscita di chimere inducibili, un lotto fratello di embrioni sono stati coltivati senza desametasone e trattati per l’ibridazione in situ. Per il test di accoppiamento (testing gap junction channel activity), sono stati analizzati 10-15 NCC per condizione per esperimento.

Immunoprecipitazione, frazionamento e western blotting

Per ogni condizione sono stati utilizzati 10-15 embrioni per la preparazione di lisati embrionali per esperimento. Embrioni interi sono stati preparati per western blot dopo omogeneizzazione in tampone di lisi (20 mM Tris, 100 mm NaCl, 0,01% Triton-X, pH 8,0) con inibitori della proteasi aggiunti (Roche, 11836153001) e inibitori della fosfatasi (Roche, 04906837001)54,64. Per western blot sono stati utilizzati i seguenti anticorpi: Connexin 43 (Sigma, C6219, 1:1000), N-cadherin (DSHB, clone MNCD2, 1:800), E- cadherin (DSHB, clone 5D3, 1:1000), p42/44 MAPK (Cell Signaling, 9102S, 1:2000), α-tubulin (DSHB, clone 12G10, 1:1000), phospho-histone H3 (Millipore, 06579, 1:2000), GFP (Invitrogen, A11122, 1: 2000), HA-tag (Sigma H6908, 1:2000), rabbit IgG HRP-linked (Amersham ECL, NA934, 1:3000), mouse IgG HRP-linked (Amersham ECL, NA931, 1:3000) and rat IgG HRP-linked (Sigma, A9037, 1:2000). Immunoprecipitation was performed using GFP-Trap® kit (Chromotek); brevemente, le cellule sono state sospese in tampone di lisi e centrifugate a 20.000×g per 5 min a 4 °C, il surnatante è stato recuperato e il volume regolato con tampone di diluizione. Le perle sono state equilibrate nel tampone di diluizione e mescolate con il lisato cellulare risospeso. Il mix è stato magneticamente purificato e preparato per Western blot. L’isolamento della frazione nucleare degli embrioni di X. laevis è stato eseguito utilizzando protocolli di centrifugazione differenziale con modifiche64, 65. Brevemente, fase 18 X. laevis embrione lisati utilizzando un ago 22 G e 20 µL omogeneizzazione buffer (HB: 250 mm saccarosio, 20 mm Hepes, 10 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, inibitori della fosfatasi e della proteasi) per embrione. Tutti i campioni sono stati centrifugati a 250×g per 5 min per rimuovere i detriti embrionali. Dopo aver raccolto il surnatante, è stato distribuito a tre diversi tubi e filato a tre diverse velocità (400×g, 600×g) per 5 min per isolare i nuclei cellulari. I supernatanti postnucleari sono stati conservati per ulteriori elaborazioni. I pellet nucleari sono stati lavati ancora una volta in buffer HG e centrifugati alla velocità appropriata (400×g, 600×g). I pellet nucleari sono stati quindi risospesi in 40 µL 10% glicerolo / 0,1% SDS / 1% Triton-X in HB. A ciascun campione è stata aggiunta una quantità adeguata di tampone e i campioni sono stati elaborati per l’elettroforesi su gel di acrilammide e l’analisi western blot. Al fine di evitare errori di carico, la stessa membrana è stata tamponata contro il controllo di carico dopo lo stripping come descritto prima54,64.

I dati Western blot sono stati analizzati utilizzando gli strumenti di analisi ImageJ. Le intensità dell’immagine sono state normalizzate e il rapporto tra la proteina di interesse e il controllo del carico (cioè, Mapk o α-tubulina) è stato calcolato, sono stati tracciati i rapporti medi. Le macchie non tagliate sono incluse come cifre supplementari(Fig. 5–7).

colture cellulari

cellule HeLa (Istituto Leibniz Collezioni di Microrganismi e di Coltura Cellulare, DSMZ, Germania) sono state coltivate in DMEM supplementato con 10% di siero fetale di vitello (Life Technologies, CA, USA) a 37 °C in atmosfera umidificata del 10% delle emissioni di CO2 e transfected come indicato Rotifect (Carl Roth, Germania) secondo le istruzioni del produttore.

I fibroblasti embrionali di Xenopus (XTC, un gentile dono di Ana Losada) sono stati coltivati in 67% DMEM/H2O integrati con siero di vitello fetale al 10% a 25 °C in un’atmosfera umidificata del 5% di CO2 e trasfettati come indicato utilizzando Viafect (Promega, USA). Plasmidi per trasfezione erano come indicato e 10-20 cellule Hela o XTC sono stati analizzati per ogni condizione per esperimento.

Per gli esperimenti siRNA, una combinazione di tre siRNA mirati contro BTF3 è stata trasfettata come descritto sopra. Un siRNA standard (scrambled siRNA da Sigma) è stato utilizzato come controllo. Numero di catalogo per questi siRNA commerciale contro BTF3 sono: SASI_Hs01_00124567; SASI_Hs02_00308337; SASI_Hs01_00124566. Le cellule sono state raccolte 48 h dopo la trasfezione e processate per esperimenti qPCR, western blot o immunoistochimici. Come descritto nelle rispettive sezioni.

Tutte le linee cellulari sono state testate per la contaminazione da micoplasma.

Colorazione di immunoistochimica e falloidina

Per il rilevamento di proteine, le cellule di mammifero o gli espianti di cresta neurale sono stati fissati in 4% formaldeide in 0,2% PBS-T (PBS + 0,2% Triton X-100) per 10 minuti e bloccati con 10% NGS per 1 ora. Gli anticorpi primari sono stati incubati a 4 °C in 10% NGS. I seguenti anticorpi sono stati utilizzati: 1/100 anti-BTF3 (Abcam, ab107213), a 2,5 µg/ml di anti-N-caderina (MNCD2 Studi di Sviluppo di Ibridoma Banca), e 1:100 anti-Cx43 (Sigma, C6219) 10% NGS e incubate a 4 °C. Espianti sono stati lavati 3 volte con PBS + 0,2% di Tween-20 e incubate a 4 °C con l’anticorpo secondario diluito a 1:350 (10% NGS. DAPI è stato diluito a 1: 1000 e miscelato con gli anticorpi secondari.

Spettrometria di massa

Per la co-immunoprecipitazione del FLAG-tagged Cx43Tail per analisi spettrometrica di massa le cellule sono state lisate e i lisati sono stati incubati durante la notte con anti-HA e perle ad alta affinità equilibrate a 4 °C, gli immunoprecipitati sono stati quindi lavati ed elutati27. Successivamente di eluizione acida con 0,1 M glicina pH 2,5, il pH degli eluati è stato regolato a pH 8,0 con 0,5 M Tris. Per la digestione delle proteine i campioni sono stati incubati durante la notte con 2 µg di tripsina (Trypsin Gold, Promega, USA) seguita da aggiunta di 0.1 µg Lys-C (Roche, Germania) e incubazione per ulteriori 6 h. I peptidi sono stati dissalati su C-18 punte a fase invertita (Nest Group, USA), essiccati sotto vuoto e conservati a -20 °C fino all’analisi. Le miscele di peptidi essiccati sono state recuperate in 3 µl di acido formico al 30% e diluite con acqua a 23 µl. Cinque µl del digest sono stati iniettati su un sistema Nano-LC (Eksigent425 2D Nano-LC; Sciex, USA) e i peptidi sono stati separati mediante cromatografia a fase inversa su colonne C-18 preparate internamente (Reprosil-Pur C18-AQ, 1.9 µm, Dr. Maisch, Germania, colonne PicoFrit, 75 µm i.d., New Obejctive, USA) in un gradiente lineare di 100% eluente A (0,1% acido formico) al 55% eluente B (60% actenitrile, 0,1% acido formico)in 120 min. Il sistema LC è stato configurato come colonna ventilata e il campione è stato caricato e dissalato a una portata di 400 nl / min e la separazione è stata effettuata a una portata di 200 nl/min. Il sistema nano-LC è stato sillabato allo spettrometro di massa (Q-Exactive HF, ThermoScientific, Germany) che è stato gestito in modalità dipendente dai dati. L’interpretazione dei dati è stata eseguita con Mascot V2.2 (Matrixscience, UK) e Progenesis LC–MS V4.1 (Nonlinear Dynamics, UK). L’interpretazione dei dati è stata eseguita con MaxQuant V1.6.1.0 e Perseus V1.6. 1. 3 (MPI di Biochimica, Germania).

Test di accoppiamento

La comunicazione intracellulare Gap junction è stata testata utilizzando un test di accoppiamento colorante. Qui è stato utilizzato il colorante fluorescente Calcein-AM (Sigma, 17783). Una popolazione di creste neurali sezionata da embrioni non iniettati è stata incubata con il colorante Calcein-AM per circa 10 minuti o fino a quando il colorante è stato caricato in tutte le cellule. Un’altra popolazione di creste neurali da embrioni iniettati con un marker nucleare (iniezioni di mRNA nRFP, vedi sopra) è stata sezionata separatamente. Dopo che le due popolazioni sono state dissociate in assenza di calcio e magnesio, sono state mescolate e incubate per 1 ora a 14 °C in una provetta. Dopo la centrifuga lieve, gli espianti della cresta neurale sono stati tagliati in pezzi di dimensioni simili e coltivati come descritto sopra e poi filmati. Per testare l’attività del canale delle giunzioni gap, sono stati utilizzati bloccanti delle giunzioni gap; acido meclofenamico (Sigma, M4531) e acido flufenamico (Sigma, F9005). La comunicazione cellulare è stata valutata stimando il rapporto tra il numero di cellule che mostrano entrambi i traccianti, il marker nucleare e la Calceina e il numero totale di cellule che hanno il marker nucleare.

Analisi statistica

La stima della dimensione del campione è stata effettuata seguendo lavori precedentemente pubblicati e non è stato utilizzato alcun metodo statistico specifico. Gli esperimenti non sono stati randomizzati e, a causa della natura degli esperimenti, gli autori non sono stati accecati all’allocazione durante entrambi gli esperimenti e l’analisi dei risultati. Sono stati analizzati solo embrioni vitali ed espianti. Gli embrioni iniettati in modo errato non sono stati inclusi per esperimenti di ibridazione in situ. La corretta iniezione è stata determinata mediante iniezione di traccianti lineari. I nostri parametri sperimentali sono stati misurati a caso una volta che sono stati selezionati embrioni vitali e iniettati correttamente.

Il confronto delle percentuali è stato eseguito utilizzando le tabelle di contingenza66. La normalità dei set di dati è stata testata utilizzando il test di Kolmogorov–Smirnov, il test di d’Agostino e Pearson e il test di Shapiro–Wilk utilizzando Prism6 (GraphPad). I set di dati che seguono la distribuzione normale sono stati confrontati con il t – test di Student (varianze a due code e disuguali) o ANOVA con i confronti multipli di Dunnett dopo il test utilizzando Excel o Prism6 (GraphPad). I set di dati che non seguivano una distribuzione normale sono stati confrontati usando il test di Mann Whitney o un ANOVA non parametrico (Kruskal Wallis con i confronti multipli di Dunn dopo il test) usando Excel o Prism6. I confronti incrociati sono stati eseguiti solo se il valore p complessivo dell’ANOVA era inferiore a 0,05. In tutte le legende di figura N = numero di esperimenti indipendenti; n = dimensione totale del campione.

X. laevis n-cadherin partial promoter identification

Per identificare il promotore di base di Xenopus n-cad abbiamo utilizzato la seguente strategia. La regione di base del promotore dai geni della n-caderina del pulcino e dei mammiferi è stata descritta alle regioni 5 ‘ – UTR,all’interno della posizione -3000 a -1 bp rispetto al sito di iniziazione della traduzione41, 67. Utilizzando la risorsa X. laevis Genome Project (https://xenopus.lab.nig.ac.jp/) abbiamo identificato una regione di 2800 bp nel 5 ‘ -UTR del gene X. laevis n-caderina(Fig. 4). Poiché i nostri dati indicano che Cx43Tail, BTF-3 e Pol II formano un complesso, usiamo ElemeNT tool68 per cercare caselle TATA potenzialmente attive nella regione che abbiamo isolato. La nostra analisi in silico rivela una regione ricca di TATA box tra le posizioni da -166 a -618 bp, relativa al sito di avvio della traduzione (Fig. 4). Infine, progettiamo primer sovrapposti per amplificare frammenti di 200 bp in tutta questa regione. Le sequenze di primer sono elencate nella sezione ChIP e le loro regioni di legame sono evidenziate in Fig. 4.

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)

Per l’immunoprecipitazione della cromatina (ChiP), abbiamo seguito una procedura standard per X. laevis embrios69,70. Per ogni esperimento indipendente abbiamo utilizzato due repliche tecniche e 250-300 embrioni di Xenopus per condizione. In breve, gli embrioni di neurula stage X. laevis sono stati fissati per 15 min e sono stati utilizzati 3 µg di anticorpo Pol II (Diagenode, C15100055) o anticorpo GFP ChIP grade (Abcam, ab290). Per l’estrazione del DNA abbiamo seguito un protocollo standard69, 70. Usando la risorsa ElemeNT analysis, abbiamo cercato le caselle TATA putative nella X. laevis n-cad promoter region (Supplementary Fig. 4). Primers flanking these TATA boxes were designed to analyze ChiP samples by PCR. PCR was performed using the following protocol 95 °C for 30 s, 56 °C for 40 s, and 72 °C for 30 s for 32 cycles. Primers used for ChiP-PCR were:

P5F: 5′-CTTCCAAGAGATGAAGCTCATAT-3′,

P5R: 5′- AACACTCTATATGGCAGATAAC-3′,

P6F: 5′-CCTTTAAATGCATACACTTACC-3′,

P6R: 5′-ACAGAAAAAGCATTTGCTTCCT-3′,

P7F: 5′-CAATCAGATCCTTATATGTCCC-3′,

P7R: 5′ – GCCAAGTTTTCCTTTTGTTGT-3′,

P8F: 5′ – GGAAGCAAATGCTTTTTCTGTC-3′,

P8R: 5 ‘- AGTCTGCTTTAGGAGACAACG-3 ‘

e i relativi siti di legame sono mostrati in Fig. 4b. Gli esperimenti di chip sono stati quantificati come segue: il rapporto normalizzato di intensità di banda per ogni condizione è stato mediato e l’aumento della piega rispetto al controllo IgG è stato calcolato e tracciato come arricchimento della piega. Intensità di banda è stato registrato utilizzando ImageJ Gel analysis plugin. I gel non tagliati sono mostrati in Fig supplementare. 7 quater, d.