genomica Comparativa di Clostridium bolteae e Clostridium clostridioforme rivela specie-specifiche proprietà genomiche e numerosi putativo di determinanti di resistenza agli antibiotici

caratteristiche Generali dei genomi rivelare intra e interspecifica variazioni

Un totale di 1 a 21 contigs sono stati generati dall’assemblaggio di legge Illumina (134 185 volte di copertura) per i sei ceppi di C. bolteae (Tabella 1). Sono stati generati da 10 a 48 contig (copertura da 82 a 264 volte) per i sei ceppi di C. clostridioforme. La dimensione totale del genoma variava tra specie e ceppi. La dimensione di C. bolteae variava da 6159 kb per il ceppo 90A7 a 6480 kb per il ceppo 90B3 con 5833 e 6059 sequenze di codifica del DNA (CDSs), rispettivamente, e quattro geni rRNA 16S. La dimensione del genoma di C. clostridioforme era più piccola, da 5467 kb per ceppo 90A3 a 5970 kb per ceppo 90A6 con 5231 a 5916 CDSs, rispettivamente, e quattro geni 16S rRNA. L’albero filogenetico basato sulle sequenze rRNA 16S ha mostrato che le C. bolteae e C. clostridioforme studiate erano strettamente correlate a C. hathewayi, C. aldenense, C. citroniae, C. saccharolyticum e C. symbiosum, membri del Clostridium cluster XIVa di Firmicutes, come riportato in precedenza (dati non mostrati).

I genomi di C. bolteae e C. clostridioforme sono genomi di grandi dimensioni, dove la ridondanza genetica è prevalente (dati non mostrati). I geni ridondanti sono stati coinvolti in una varietà di vie metaboliche, tra cui il metabolismo del carbonio, il trasporto, il metabolismo del ferro e la biosintesi degli aminoacidi. Le differenze nel numero di CDSS tra i genomi riflettevano la variazione della ridondanza genetica più del guadagno o della perdita di particolari funzioni. Inoltre, i genomi integravano elementi mobili come trasposoni, sequenze di inserzione, plasmidi o fagi (integrasi, proteina capsidica,…) indicativi di trasferimenti genici laterali. Alcuni di loro portavano geni di resistenza antimicrobica (vedi sotto).

Per esaminare il pangenoma delle due specie, abbiamo confrontato i 97.210 CDSS ottenuti dai 12 genomi appena sequenziati con quelli di altri cinque genomi (C. bolteae BAA613, C. bolteae WAL-14578, C. clostridioforme CM201.1, C. clostridioforme 2149FAA.1, e C. clostridioforme WAL-7855). Tutti i CDS sono stati raggruppati utilizzando l’algoritmo BlastClust ad alta stringenza, al di sopra di un cut-off di identità di sequenza del 90% e sovrapposizione di lunghezza del 90%. Sono stati trovati un totale di 10.530 cluster. Solo 2294 (21,78%) cluster sono stati condivisi dalle due specie.

Utilizzando solo genomi appena sequenziati, abbiamo stimato il genoma del nucleo (specie) e i geni (specifici del ceppo) dei sei C. bolteae e dei sei C. clostridioforme (Tabella 1). Un totale di 3714 geni hanno formato il genoma principale di C. bolteae. Il numero di geni specifici del ceppo in questa specie variava da 73 a 846. In C. clostridioforme, 3660 geni hanno definito il genoma principale. Un totale di 2409 cluster sono stati condivisi dalle due specie; 1305 geni erano specifici per C. bolteae e 1251 per C. clostridioforme.

C. bolteae 90A7 e 90B8 avevano il maggior numero di geni unici per questa specie (735 e 846, rispettivamente). C. clostridioforme 90A8, con 1006 (17 %) geni unici ha avuto il maggior numero di geni specifici del ceppo in questo studio. Questi ceppi integravano un elevato numero di elementi mobili. Alcuni CDS unici sono stati annotati come trasportatori o regolatori. Pochi di loro erano coinvolti in meccanismi di difesa (geni di resistenza antimicrobica..) o vie metaboliche. La maggior parte di essi, spesso circondati da CDS da fagi o trasposoni, erano di funzioni sconosciute (dati non mostrati).

Differenze funzionali tra le specie nei genomi principali

La sfida del nostro studio era fornire informazioni affidabili dai progetti di genomi. Pertanto, abbiamo focalizzato la nostra analisi sui genomi principali. La classificazione dei CDSS secondo il sistema Cluster of Orthologous Groups (COGs) ha permesso di dare una panoramica delle funzioni visualizzate dalle due specie. I genomi principali di C. bolteae e C. le clostridioforme sono state arricchite (oltre il 7% delle conteggi totali corrispondenti a COG) nelle categorie COG K, E, G e R relative alla trascrizione (309 e 290 CDSs), al trasporto e al metabolismo degli aminoacidi (335 e 276 CDSs), al trasporto e al metabolismo dei carboidrati (431 e 425 CDSs) e alla predizione generale della funzione (366 e 331CDSs) (Tabella 2).

Mentre C. bolteae e C. le clostridioforme sono fenotipicamente correlate, il modello di funzioni ottenuto attraverso il cambiamento nell’annotazione COG differiva tra le due specie (Tabella 2). 30 CDSS aggiuntivi del trasporto e metabolismo dei nucleotidi (F), 97 CDSS del trasporto e metabolismo degli amminoacidi (E) e 79 CDSS che codificano per le categorie dei meccanismi di trasduzione del segnale (T) erano specifici per C. bolteae. 40 CDSS che codificano per la biogenesi della parete cellulare/membrana/involucro (M), 50 CDSS per la replicazione, la ricombinazione e la riparazione (L) e 18 CDSS per il trasporto lipidico e il metabolismo (I) sono stati specifici per C. clostridioforme. Le differenze tra le vie metaboliche in C. clostridioforme e C. bolteae sembrano essere abbastanza grandi da supportare la delineazione della specie.

Tra le vie dei carboidrati, C. bolteae e C. clostridioforme ospitavano diversi sistemi per l’assimilazione del lattosio, che differiscono nei loro stati di fosforilazione, metaboliti intermedi e bioenergetica (File aggiuntivo 1: Tabella S1). Geni che codificano per una β-galattosidasi, che idrolizza il lattosio producendo glucosio e galattosio, sono stati trovati in entrambe le specie. Una via catabolica alternativa del lattosio, il sistema lattosio/cellobiosio-dipendente della fosfotransferasi (lac/cell-PTS) è stata trovata in quasi tutti i genomi di C. bolteae. L’operone lac / cell-PTS, precedentemente descritto in C. acetobutylicum, è costituito da geni per la 6-fosfo-β-galattosidasi, fosfoglicerato mutasi, e lichenan operon trascrizionale antiterminator e di due copie di geni per lattosio/cellobiose famiglia IIC, IIB e IIA componenti. Con un tale sistema, il lattosio viene fosforilato al carbonio C-6 e il lattosio 6-fosfato internalizzato viene degradato in galattosio 6-fosfato e glucosio dalla 6-fosfo-β-galattosidasi. Inoltre, il gene per la 6-fosfo-β-galattosidasi e i geni per i componenti della famiglia lattosio/cellobiosio mancavano in C. bolteae 90A7. È probabile che questo sistema, inducibile da cellobiosio o lattosio e regolato da diversi repressori (descritti in altri batteri Gram positivi ) rappresenti il fenotipo lattosio-negativo in C. bolteae . Utilizzando il nostro sistema di annotazione, abbiamo rilevato un galattosio operon repressor (GalR) tra i regolatori della famiglia lacI, in C. clostridioforme (tutti, tranne 90A8), ma non in C. bolteae. Sono necessari esperimenti di laboratorio per determinare in che modo i fattori di trascrizione delle due specie mediano le preferenze nell’utilizzo di determinati carboidrati rispetto ad altri.

Altre caratteristiche distintive tra le due specie erano i CDSS che codificano per la biosintesi dei metaboliti secondari e il trasporto e il catabolismo che sono stati trovati solo in C. bolteae (Tabella 2).

È interessante notare che il numero di geni della motilità cellulare e della categoria di secrezione (N) (34 e 18 CDSs) era diverso tra le due specie. Tra questi, abbiamo trovato CDSS che codifica la motilità dei flagelli riconosciuti come fattori di virulenza essenziali per la maggior parte dei patogeni mobili. Nel complesso, ventiquattro geni (46 cluster + 3 orfani) rappresentavano l’operone flagellare nei genomi di C. bolteae. Tra questi, i geni per flagellin (fliC) e flagellar cap (fliD), una delle adesine multiple della superficie cellulare dei batteri, hanno rivelato la specificità del cluster e la microevoluzione. I geni che codificano per il fliD sono stati rappresentati da un cluster e da due geni aggiuntivi in C. bolteae 90A7 e 90B8. Le sequenze FliC di C. bolteae 90A9, 90B3 e 90B8 formarono un cluster, quelle di 90A5 e 90B7 raggruppate in un altro gruppo, e le sequenze di C. bolteae 90A7 rimasero orfane (geni unici) dopo il clustering (Fig. 1). Erano strettamente correlati alle sequenze di flagelline di C. citroniae e C. hathewayi, altri Clostridium spp. del gruppo XIVa, isolato occasionalmente da infezioni umane. Inoltre, C. bolteae 90A9 e 90B3 hanno condiviso un secondo operone di soli 19 geni in syntheny, incluso un gene flagellin (flaA) strettamente correlato a quelli di C. clostridioforme (63% identità). Sulla base dei residui conservati L87, Q88, R89 e Q96 critici per la segnalazione TLR5 e la polimerizzazione della flagellina, è stato previsto che queste proteine abbiano proprietà pro-infiammatorie . In C. clostridioforme, venti geni (altri 57 cluster) organizzati in un singolo operone codificavano l’apparato flagellare. Sequenze FlaA da C. clostridioforme apparteneva a un gruppo filogenetico strettamente correlato alle sequenze di flagelline da Eubacterium cellulosovens isolate dal rumine. Nel complesso, i geni della flagellina e l’organizzazione dei loci relativi ai flagelli erano diversi tra le specie (file aggiuntivo 2: Tabella S2 e file aggiuntivo 3: Tabella S3), suggerendo che la motilità, la chemiotassi e l’insorgenza di potenziali interazioni con la mucosa del colon sono specie specifiche .

Albero filogenetico a distanza dei geni della flagellina. I valori ai nodi corrispondevano alle percentuali di bootstrap ottenute da alberi filogenetici basati su allineamenti di sequenze multiple di ClustalW, Tcoffee o Promals, rispettivamente. Sono stati indicati i nomi dei geni e i numeri degli orfani o dei cluster

Differenze di specie nei percorsi per la sintesi del butirrato

Il confronto delle sequenze di genoma intero ha rivelato che i percorsi per la sintesi del butirrato, che svolgono un ruolo chiave nella salute del colon negli esseri umani, erano presenti in C. bolteae e C. clostridioforme.

Le due specie erano produttori di butirrati attraverso modi diversi e complementari (Fig. 2, File aggiuntivo 4: Tabella S4). Tutti i C. clostridioforme, ad eccezione di 90A8, presentavano un locus codificante per la via Acetil-CoA (da Acetil-CoA a butirril-CoA), compresi i geni per la beta-idrossilbutirrilcoa deidrogenasi (hbd), tiolasi (thl), crotonasi (cro), butirril-CoA deidrogenasi (bcd) e due proteine di trasferimento elettronico (ETF alfa, ETF beta) (File aggiuntivo 4: Tabella S4). Solo, C. bolteae 90A8 e C. clostridioforme 2149FAA.1 conteneva un altro bcd putativo (74.9% identità) nei loro genomi (dati non mostrati). La composizione e la disposizione del locus erano simili a quelle del Faecalibacterium prausnitzii, un importante produttore di butirrato dell’intestino crasso umano . La via Acetil-CoA non è stata trovata in C. bolteae. Entrambe le specie hanno condiviso i geni per i due idrossi-glutaril-CoA deidrogenasi (HgCoAd) e la glutaconil-CoA decarbossilasi (Gcd) dalla via del glutarato che può portare al crotonil CoA e al butirril-CoA attraverso i geni bcd .

Diversi percorsi di sintesi del butirrato potenzialmente presenti nei genomi di C. clostridioforme e C. bolteae. In linee continue: trovato in C. bolteae e C. clostridioforme; In grassetto linee tratteggiate : trovato solo in C. clostridioforme ; In linee tratteggiate fini: trovato solo in C. bolteae 90A5 e 90B7 (per maggiori dettagli, vedere il file aggiuntivo 4: Tabella S4). Vengono visualizzati i geni (nomi di proteine). Ato, Acetil-CoA acetiltransferasi; Bcd, butiril-CoA desidrogenasi; Buk, butirrato chinasi; Butirrato-acetoacetato COA-transferasi; Cro, crotonasi ; Etf, il trasferimento di elettroni di proteine ; Gcd, glutaconyl-CoA decarbossilasi ; Hbd, Acetoacetyl-CoA reduttasi ; 4Hbt, 4-idrossibutirrato CoA transferasi ; HgCoAd, 3-hydroxybutyryl-CoA deidrogenasi ; Ptb, fosfato butyryltranferase; Thl, thiolase

La conversione finale da butyryl-CoA per butirrato può essere eseguita con il butirrato chinasi (buk) e il phosphotransbutyrylase (ptb), presente in entrambe le specie (file Aggiuntivo 4: Tabella S4). Il gruppo di sequenze buk da C. clostridioforme ramificato in prossimità della sequenza buk da C. citroniae sull’albero filogenetico (File aggiuntivo 5: Figura S1). Le sequenze di Buk da C. bolteae formavano gruppi monofiletici distinti e sequenze distribuite tra gli alberi filogenetici, suggerendo polimorfismo e / o variazioni funzionali dell’enzima in questa specie. Altri geni per le transferasi dalla via della lisina (subunità ato—alfa e beta ; but-acetato COA transferasi), rilevati vicino al locus del butirrato in sei genomi di C. clostridioforme, possono essere coinvolti come enzimi finali. I geni dalla via 4-aminobutirrato (4hbt) possono essere un’altra alternativa per la fase terminale in C. bolteae 90A5, 90B7, WAL14578 e BAA613 .

La butirril-CoA:acetato COA-transferasi (but) della via acetil-CoA, la fase finale della produzione di butirrato predominante nel Clostridium XIVa, non è stata trovata né nei genomi a nucleo comune né nei genomi del C. bolteae studiato . Nell’intestino umano, studi precedenti su isolati del colon di individui sani hanno dimostrato che la via predomina. Sono necessari ulteriori studi per valutare l’impatto della produzione di butirrato attraverso la via del glutarato sulla salute delle cellule del colon, in particolare nell’autismo in cui C. bolteae è sovrabbondante .

Identificazione dei determinanti di resistenza agli antibiotici

I geni di resistenza ai farmaci che non erano stati riconosciuti dall’annotazione automatizzata sono stati identificati dalla ricerca sulla sequenza di omologia su ARDB. I geni di resistenza sono stati previsti su un valore fino al 40% di identità (50% di sostituzioni positive) su un 70% di lunghezza superiore al valore di cut-off solitamente raccomandato (vedere elenco nella Tabella 3). Quindi, il contenuto genetico e l’organizzazione genetica dei loci di resistenza microbica dei sei C. bolteae e dei sei C. clostridioforme sono stati confrontati con i dati precedenti ottenuti da C. clostridioforme CM201.1 nel nostro laboratorio.

Poiché le previsioni basate sulla sequenza potrebbero potenzialmente identificare determinanti che non portano alla resistenza antimicrobica, sono stati eseguiti test di suscettibilità per ottenere informazioni sulla risposta prevista dei batteri agli antibiotici. I ceppi inclusi in questo studio hanno mostrato modelli di resistenza, tra cui ampicillina, macrolidi, lincomicina e chinoloni, ora comuni negli anaerobi (Tabella 4). Sia i dati genomici (CDSS e annotazioni) che i test di suscettibilità fenotipica sono stati considerati per identificare i determinanti della resistenza agli antibiotici (Tabelle 3 e 4). Sono stati eseguiti anche test preliminari per la clonazione di alcuni geni al fine di verificare la loro capacità di conferire resistenza agli antibiotici (vedi sotto).

Geni di resistenza agli antibiotici utilizzati per il trattamento delle infezioni anaerobiche

Sono stati identificati un totale di 76 cluster e 21 geni ceppo-specifici potenzialmente coinvolti nella resistenza antimicrobica (Tabella 3). È incluso da 42 a 50 CDSS in C. bolteae e da 48 a 58 CDSS in C. clostridioforme. Da 27 a 42 CDSS per genomi sono stati correlati ai meccanismi di resistenza ai farmaci a beta-lattamici, glicopeptidi, macrolidi, lincosamidi e metronidazolo.

Sette cluster coinvolti nella resistenza beta-lattamica sono condivisi o parte del genoma principale delle due specie (Fig. 3). Tre tipi di beta-lattamasi, tra cui beta-lattamasi di classe A, beta-lattamasi di classe C, beta-lattamasi di classe D e diversi metallo-enzimi sono stati riconosciuti nei dodici genomi. Tutti i ceppi studiati, selezionati per la loro resistenza all’ampicillina, condividevano il gene blaCLO1, precedentemente trovato in C. clostridioforme CM201.1 (inedito), ma la struttura dell’elemento coniugativo integrativo (ICE) osservata in CM201.1 non è stata trovata nei nuovi genomi sequenziati. Il gene blaCLO1 conferisce resistenza alle aminopenicilline e carbossipenicilline in E. coli e la sua attività è inibita dal clavulanato e dal sulbactam. Sono state osservate nove alterazioni aminoacidiche nelle beta-lattamasi di C. bolteae 90A9, 90B3 e 90A8. Questa beta-lattamasi strettamente correlata è stata affiancata da sequenze di inserzione (IS66) e da un gene putativo per la beta-lattamasi di classe D (COG 2602) descritto anche in Clostridium sp M62/1 dalla microflora intestinale umana (progetto HMP). I geni per le beta-lattamasi di classe C, precedentemente trovati nei cromosomi dei batteri enterici (COG2680), erano presenti anche in C. bolteae e C. clostridioforme.

Distribuzione dei geni di resistenza agli antibiotici condivisi tra e all’interno del nucleo di C. bolteae e C. clostridioforme. Geni che si sovrapponevano almeno al 90% di lunghezza e al 90% di somiglianza sono stati considerati omologhi. I geni di resistenza sono stati predetti su un valore fino al 40% di identità (50% di sostituzioni positive) su 70% di lunghezza dalla ricerca sulla sequenza di omologia su ARDB. Per tutti C. clostridioforme e alcuni C. bolteae 23S rRNA metiltransferasi Cfr-like

Un elevato numero di geni previsti (32 CDSS) sono stati coinvolti nella resistenza ai glicopeptidi (File aggiuntivo 6: Figura S2). C. clostridioforme 90A8 era il singolo ceppo con tutti i geni necessari per la resistenza glicopeptidica in accordo con il fenotipo (MIC > 256 mg/l). La resistenza alla vancomicina in questo ceppo è stata attribuita a un operone di tipo VanB sopportato da un elemento simile a Tn1549. Sfortunatamente, una delezione di dieci nucleotidi all’interno del gene relaxasi di Tn1549 porta all’incapacità di 90A8 di trasferire la resistenza alla vancomicina in vitro . Gli altri genomi di C. clostridioforme includevano parte dell’operone di resistenza alla vancomicina di tipo VanD, ma il gene della ligasi VAND D-Ala-Lac era interrotto da un codone di arresto che portava a una proteina troncata (File aggiuntivo 6: Figura S2). Inoltre vanH e vanY, che codificano rispettivamente una D-lattato deidrogenasi e una DD carbossipeptidasi, mancavano. Allo stesso modo, i genomi di C. bolteae ospitava quattro CDSS, omologo di vanRG vanUG Vang vanYG, che formavano un operone incompleto e non funzionale a causa della mancanza di un gene della serina racemasi. L’elevato numero di CDSS che codificano per la resistenza glicopeptidica (inclusi vanD o vanG noti per essere cromosomici e non trasferibili) trovati nei genomi di C. bolteae e C. clostridioforme, suggerisce che fanno parte di interi operoni ancestrali, che si sono evoluti in assenza di pressione selettiva antibiotica . La presenza di van operon incompleto è intrigante, ma osservazioni simili in altri anaerobi che vivono in microbiomi come Clostridium difficile 630 o Ruminococcus spp., sono stati segnalati .

Omologhi al gene adenililtransferasi che conferisce resistenza ai lincosamidi, erano presenti nel genoma principale di entrambe le specie (Fig. 3). I geni LnuA di C. clostridioforme e C. bolteae avevano dal 70 al 72% di identità con ortologhi trovati rispettivamente in C. hathewayi e C. citroniae. C. clostridioforme 90B1 e 90A6 ospitavano un gene lnu aggiuntivo (identità al 68% con LnuA90A5), senza tracce di elementi mobili. La resistenza alla lincomicina è comune in C. bolteae e C. clostridioforme, spesso associata alla resistenza alla clindamicina. Le proteine LnuA delle due specie hanno mostrato dal 51 al 54% dell’identità con LnuA da stafilococco suggerendo funzionalità comuni, ma il ruolo dei geni lnu è difficile da stabilire a causa della presenza di altri meccanismi putativi . Allo stesso modo, tutti i ceppi erano resistenti all’eritromicina, mentre due geni omolog al gene dell’eritromicina ribosoma metilasi, ermB, erano previsti solo nei genomi di C. clostridioforme 90A4 e 90A8. La sovraespressione di pompe di efflusso multidrug e sistemi di efflusso specifici per macrolidi e vari macrolidi-Lincosamide-streptogramina B, come MacB, MefA, VgaA, MsrA/MsrB e CcmA (Tabella 3, File aggiuntivo 7: Figura S3), trovati nei genomi studiati, può portare a resistenza ai macrolidi e alla lincosamide . Inoltre, due cluster di CDSS che codificano per acetiltransferasi xenobiotiche correlate a VatB (identità 48%) sono stati trovati nei genomi principali di ciascuna specie (Fig. 3). VatB inattiva la virginiamicina, ma qui la resistenza non è stata rilevata dai test di suscettibilità antimicrobica (Tabella 4).

Un gruppo di omologhi CDSs ai geni di resistenza al metronidazolo (nim) è stato rilevato nei genomi principali di entrambe le specie e il metronidazolo è stato molto attivo sulle specie studiate . In Bacteroides fragilis è stato dimostrato che una maggiore espressione dei geni nim quando a valle degli elementi IS porta alla resistenza al metronidazolo . Nella mancanza di è direttamente a monte dei geni nim, il meccanismo per conferire resistenza metronidazolo a C. bolteae e C. clostridioforme rimane da stabilire.

Osservazione inaspettata di nuovi geni di resistenza

Per quanto riguarda altre resistenze ai farmaci, i dati del genoma hanno rivelato geni correlati ai meccanismi di resistenza al cloramfenicolo e alla rifampicina (Tabella 3). Nella maggior parte dei genomi di ogni specie, abbiamo trovato CDSS codifica per un gruppo A cloramfenicolo acetiltransferasi che può inattivare cloramfenicolo. Tuttavia, solo C. bolteae 90B3 e 90B8 erano resistenti al cloramfenicolo. Il genoma del ceppo 90B8 conteneva una seconda copia del gene cat a carico di un trasposone simile a Tn4451 (identità 96 e 90% con Tn4451 e Tn4453, rispettivamente). Il genoma 90B3 conteneva un omologo CDS al gene cfr che codifica per una 23S rRNA metil-transferasi ampiamente diffusa nei batteri Gram-positivi. Come previsto, il ceppo 90B3 era anche resistente a florfenicolo, tiamulina e linezolid (MIC = 16 mg/l). Altri 23S rRNA metiltransferasi (Cfr-like) CDSs sono stati rilevati in un ambiente ricco di elementi trasponibili (Tn 6103-6110-CTn4) nei genomi di C. clostridioforme e C. bolteae 90A5 e 90B7, ma la metilazione rRNA non sembra influenzare la suscettibilità al cloramfenicolo (Fig. 3).

L’analisi dei dati genomici ha permesso di riconoscere gli omologhi CDSs ai geni rifampicina-ADP-ribosiltransferasi (arr) in C. bolteae ma non in C. clostridioforme. Nessun elemento mobile o tracce di elementi mobili sono stati trovati intorno ai geni arr suggerendo che fossero indigeni di questa specie. Queste nuove sequenze Arr si sono ramificate in prossimità delle proteine Arr di C. saccharoperbutylacetonicum e di alcuni cianobatteri sull’albero filogenetico (File aggiuntivo 8: Figura S4). Erano distinti dalle proteine Arr-2 delle enterobacteriaceae e dalle proteine Arr di Mycobacterium e Streptomyces spp.. Tutti i ceppi, tranne 90A7, erano sensibili alla rifampicina. In assenza di mutazioni in rpoB (noto per essere responsabile della resistenza alla rifampicina), resistenza di C. bolteae 90A7 (MIC: 32 mg / l) è stato probabilmente dovuto alla selezione positiva di mutazioni in aar Cbol90A7. La suscettibilità alla rifampicina di altri C. bolteae è stata probabilmente dovuta alla mancanza di promotori a monte di arr (come previsto dall’analisi in silico) o a sostituzioni nucleotidiche all’interno di arr che hanno portato alla sostituzione di aminoacidi e all’inattivazione funzionale (dati non mostrati).

Per quanto riguarda la resistenza di tutti i ceppi contro moxifloxacina e ciprofloxacina, tutti i ceppi di C. bolteae hanno mostrato diverse sostituzioni nella “regione che determina la resistenza ai chinoloni” (QRDR) di gyrB. Non abbiamo trovato alcuna sostituzione in questa regione per gyrA, né descritto nella proteina del ceppo epidemico resistente ai chinoloni, C. difficile 027 . Pertanto, il GyrB era probabilmente l’obiettivo preferito nell’acquisizione della resistenza ai chinoloni in queste due specie. Inoltre, diversi CDSS che codificano per ACRB inner membrane transporter erano presenti in tutti i ceppi. Questi trasportatori fanno parte di una pompa di efflusso multidrug di resistenza-nodulazione-divisione, nota per aumentare l’efflusso di chinoloni in alcuni batteri Gram-negativi . Ulteriori studi sono necessari per determinare la loro influenza nella perdita di suscettibilità di Clostridium spp. ai fluorochinoloni.

Nel complesso, profili di resistenza simili contro gli antibiotici in C. bolteae e C. clostridioforme possono derivare da vari meccanismi.

Geni di resistenza agli antibiotici meno attivi o inattivi contro Clostridium spp

I genomi di C. bolteae e C.clostridioforme trasportava una o due copie del gene dell’undecaprenil pirofosfato fosfatasi bacA, e da 2 a 5 copie dei geni della pompa di efflusso, bcrA, coinvolti nella resistenza alla bacitracina, in accordo con la loro bassa suscettibilità . Abbiamo anche trovato un cluster di CDSs omologo al gene della diidrofolato reduttasi, dfrA20 (41% identity / 97% length) di Pasteurella multocida nel genoma principale di entrambe le specie che potrebbe spiegare la scarsa attività del trimetoprim sul nostro Clostridium spp. . Inoltre, C. clostridioforme 90A6 ospitava un CDS identico a dfrA da Enterococcus faecium. Questo gene rilevato in un ambiente ricco di elementi mobili è coerente con un nuovo esempio di trasferimento orizzontale tra Enterococcus spp. e Clostridiales.

È interessante notare che i genomi di C. bolteae o C. clostridioforme contenevano vari geni di resistenza contro gli antibiotici naturalmente inattivi su queste specie. Cinque CDSS erano omologhi di geni che fosforilano, acetilano o adenililano aminoglicosidi. Quattro di questi geni di resistenza putativa sono stati rilevati in un ambiente di elementi mobili. Tre geni, aadE, sat4 e aph (3′) – III, che conferiscono resistenza alla streptotricina, alla streptomicina e alla kanamicina, rispettivamente, sono stati trovati parte di un trasposone delineato da due copie IS1182 in C. clostridioforme 90A3 (due copie), 90A6 e 90B1. L’aph(3′)-III rilevato era identico all’aph (3′) – III, parte del plasmide multiresistente PF856 di E. faecium , anche correlato a un dominio interno (identità al 99%) di un elemento SSCmec di Staphylococcus aureus HT20040085. Allo stesso modo, il gene ant(6′)-Ia dell’aminoglicoside 6-adenililtransferasi, che conferisce resistenza alla streptomicina, è stato condiviso da C. clostridioforme 90A1, 90A3 (2 copie), 90A4, 90A6 (2 copie) e C. bolteae 90A7. Il gene dell’adenililtransferasi aad (9′)-b che media la resistenza alla streptomicina/spectinomicina è stato trovato in C. bolteae 90B3. Due copie dell’acetil transferasi aac (6′)-Im erano presenti anche nel genoma di C. clostridioforme 90B1. Omologhi di AAC (6′)-Im che conferisce resistenza alla tobramicina e amikacina resistenza è stata trovata anche in E. coli (96% identità), Coprococcus sp, C. difficile e Enterococcus faecium (dati non mostrati). Inoltre, tre CDSS che codificano per una chinasi aminoglicosidica (APH), nota per essere ampiamente distribuita nei batteri Gram-positivi, sono stati osservati anche tra tutti i ceppi .

Numerosi geni di resistenza alle tetracicline sono stati rilevati anche in C. bolteae e C. clostridioforme. Includono entrambi i geni di efflusso come tet40 e determinanti di protezione del ribosoma come tetO, tetW e tet32, precedentemente riportati come circolanti nella microflora intestinale tra batteri distanti.