Il collagene di tipo III è cruciale per la fibrillogenesi del collagene I e per il normale sviluppo cardiovascolare

RISULTATI E DISCUSSIONE

Le cellule ES (J-1) (22) sono state trasfettate con un vettore di targeting contenente un frammento di DNA genomico del gene Col3a1 in cui la regione promotrice del gene e il primo esone che codifica 1 BIS). Cloni di cellule ES mirati sono stati identificati mediante analisi Southern blot e utilizzati per l’iniezione di blastocisti (Fig. 1B Superiore). I topi mutanti sono stati derivati da due cloni di cellule ES mirati in modo indipendente e identificati dall’analisi Southern blot (Fig. 1B Inferiore). L’analisi delle proteine del collagene della coda e della pelle ha mostrato che i topi mutanti eterozigoti hanno una riduzione di circa il 50% del collagene di tipo III, mentre nessun collagene di tipo III è stato rilevato negli animali mutanti omozigoti (Fig. 1C).

Gli animali mutanti erano fertili ma solo i topi eterozigoti erano fenotipicamente normali. I topi mutanti omozigoti hanno mostrato un tasso di sopravvivenza medio del 5% all’età dello svezzamento, con la maggior parte dei decessi che si sono verificati entro le prime 48 ore dopo la nascita (Tabella 1). La causa precisa della mortalità neonatale non è chiara perché i cuccioli morti sono stati cannibalizzati prima che potessero essere esaminati, e l’analisi istologica microscopica leggera di mutanti omozigoti neonati vivi non ha rilevato alcuna anomalia grossolana. I topi mutanti omozigoti adulti apparivano normali tranne che erano circa il 15% più piccoli dei loro compagni di letteratura wild-type dello stesso sesso (dati non mostrati). La durata media della vita dei topi mutanti omozigoti era, tuttavia, circa 6 mesi o un quinto della normale durata della vita. L’autopsia ha mostrato che la rottura dei vasi sanguigni era la causa principale della vita accorciata di questi topi (Tabella 2). I siti di rottura erano sporadici e per lo più associati a grandi vasi sanguigni. L’analisi istochimica è stata effettuata per trovare il difetto che ha causato la fragilità della parete dei vasi sanguigni. Fico. 2 A e B mostrano una sezione trasversale dell’aorta addominale normale. Il muro dell’aorta è costituito da intima e media (Fig. 2A, freccia) e avventizia (Fig. 2 A e B, punte di freccia). Il mezzo è costituito da fibre elastiche (Fig. 2B, grandi frecce) e cellule muscolari lisce (Fig. 2B, piccole frecce) e fornisce l’elasticità dell’aorta mentre l’avventizia comprende principalmente fibrille di collagene di tipo I e limita la dilatazione dell’aorta. Fico. 2C mostra una sezione trasversale di un aneurisma dissecante dell’aorta addominale da un topo mutante omozigote. La rottura attraversò il supporto (freccia), che portò a un canale pieno di sangue (stella) tra media e avventizia (punte di freccia) e parzialmente collassò il lume dell’aorta. L’avventizia alla fine si è rotta altrove e il sangue è fuoriuscito nella cavità peritoneale come nel caso degli esseri umani con aneurisma aortico letale (20). La disposizione generale delle fibre elastiche e delle cellule muscolari lisce (Fig. 2D) era simile a quella dei controlli (Fig. 2 TER). L’intensità e la distribuzione del materiale della matrice extracellulare e la colorazione più scura nell’avventizia e tra fibre elastiche e cellule muscolari lisce nell’intima dei topi mutanti (Fig. 2D) erano paragonabili a quelli dei controlli wild-type (Fig. 2 TER). Non sono stati osservati difetti evidenti del cuore e delle arterie medie e piccole negli animali mutanti al microscopio ottico (dati non mostrati).

Oltre all’aneurisma, i topi mutanti hanno mostrato frequenti ingrossamenti intestinali e occasionali rotture intestinali con conseguente morte (Tabella 2). Circa il 60% dei topi mutanti omozigoti mostrava lesioni cutanee, la più grave delle quali si presentava come una ferita aperta di ≈1 cm di lunghezza nella zona della spalla, che penetrava completamente nella pelle ed esponeva il tessuto subdermico (Fig. 3). Le ferite non erano dovute a combattimenti tra animali, dal momento che sono stati osservati in animali in gabbia separatamente. L’analisi microscopica leggera di pelle, intestino e altri organi interni, inclusi fegato e polmoni, non ha rilevato alcuna anomalia palese negli animali mutanti (dati non mostrati).

Per definire i difetti strutturali negli animali mutanti, sono state effettuate analisi al microscopio elettronico dell’aorta e del cuore. Fico. 4 mostra che le fibrille di collagene situate tra le cellule muscolari lisce o tra le cellule muscolari lisce e le fibre elastiche (Fig. 4A, frecce) erano assenti o gravemente ridotti nei media dell’aorta mutante (Fig. 4B, frecce). Più sorprendentemente, nell’avventizia dove la maggior parte del collagene è di tipo I, il diametro delle fibrille di collagene dell’aorta mutante era altamente variabile(confronta Fig. 4 Da D a C). Quando le fibrille sono state contate e il diametro di queste fibrille misurato in una data area dell’avventizia, abbiamo scoperto che il numero di fibrille nei mutanti era ridotto a circa un terzo di quello di wild-type mentre il diametro medio delle fibrille nei mutanti era circa il doppio di quello dei topi wild-type (Fig. 5). Simile all’aorta, le fibrille di collagene tra epicardio e miocardio erano ridotte o mancanti e i microvilli dell’epicardio erano sottosviluppati nel cuore dei topi mutanti (dati non mostrati).

Oltre al sistema cardiovascolare, la pelle, l’intestino, il fegato e il polmone dei topi mutanti sono stati esaminati al microscopio elettronico. Come con l’avventizia dell’aorta, il collagene I fibrilla nella pelle mutante (Fig. 4F, frecce e punte di freccia) erano disorganizzati e avevano un diametro molto variabile rispetto a quelli dei topi wild-type(Fig. 4E, frecce). Questa alterazione è stata osservata anche nel fegato e nei polmoni di topi mutanti (dati non mostrati). Inoltre, le fibrille di collagene erano mancanti o altamente ridotte nella sottomucosa e nella sierosa degli intestini mutanti (dati non mostrati) suggerendo che le fibrille di collagene in queste aree sono principalmente fibrille di collagene di tipo III.

Studi precedenti che introducevano mutazioni mirate nei geni Col1a1, Col2a1, Col5a2 e Col9a1 hanno portato importanti intuizioni sulla funzione di questi collageni (24-27). Qui mostriamo che il collagene di tipo III ha un ruolo critico nella fibrillogenesi, che è una parte importante dello sviluppo di organi come il sistema cardiovascolare, l’intestino e la pelle. La mancanza di collagene di tipo III ha disturbato la fibrillogenesi e ha provocato uno sviluppo difettoso e un fallimento funzionale di questi organi. In condizioni fisiologiche, il collagene di tipo III non è solo un componente essenziale delle fibrille nei tessuti come i media dell’aorta, ma anche un importante elemento regolatore nella fibrillogenesi del collagene di tipo I. I nostri risultati suggeriscono che il collagene di tipo III regola il diametro delle fibrille di collagene di tipo I, che funge da meccanismo per soddisfare i requisiti fisiologici di diversi tessuti o di un tessuto in diversi stadi di sviluppo. Il fenotipo dei topi carenti di collagene di tipo III assomiglia molto alle manifestazioni cliniche dei pazienti con sindrome di Ehlers–Danlos di tipo IV in cui la morte deriva da vasi sanguigni o rottura intestinale (20). Questi topi mutanti dovrebbero, quindi, dimostrare di essere buoni modelli animali per comprendere questa malattia e possibilmente testare approcci terapeutici.