il Rilevamento e l’identificazione mediante PCR di Clostridium chauvoei in isolati clinici, bovini feci e substrati da impianto a biogas
Campioni sospetti casi di crumiro
Per campioni di muscolo da casi sospetti di crumiro, i risultati della cultura sul FAA piastre seguita da PCR colony materiale fosse in accordo con, o eseguite anche meglio, di biochimica metodo di identificazione (Tabella 2). Questi risultati sono coerenti con Uzal et al. . Questo studio ha dimostrato che la preparazione del DNA dalla coltura prima della PCR ha dato risultati migliori rispetto alla PCR applicata direttamente sulla biomassa.
La coltura seguita da metodi di identificazione biochimica è complicata in campioni con un alto contenuto di flora contaminante a causa della necessità di coltura pura e la sensibilità era sostanzialmente inferiore rispetto alla coltura e alla PCR. In otto casi è stato impossibile rilevare C. chauvoei mediante coltura e identificazione biochimica, ma l’organismo è stato rilevato mediante PCR (Tabella 2). Per fare una diagnosi di blackleg, il tessuto muscolare viene prelevato all’autopsia poiché la quantità di C. chauvoei probabilmente è più alta nel tessuto muscolare che nel sangue. Il singolo campione di sangue è stato prelevato in modo errato, ma la domanda era blackleg.
Allo stesso modo, in un precedente studio su un’epidemia di blackleg, la coltura e la rilevazione mediante PCR hanno dato risultati migliori rispetto all’analisi biochimica . In uno dei casi, la coltura primaria di un muscolo su una piastra di agar del sangue è stata ricoperta da C. septicum ma ha dato chiari risultati positivi per C. chauvoei nella PCR.
Nella maggior parte dei casi clinici di blackleg la quantità di C. chauvoei nel tessuto infetto è alto e può essere facilmente rilevato con il metodo PCR indipendente dalla flora contaminante. Inoltre, il metodo PCR è molto più veloce del metodo di rilevamento biochimico tradizionale, che richiede almeno cinque giorni, ed è importante avere una coltura pura del ceppo, che potrebbe richiedere più tempo per la coltura. Per evitare di contaminare la flora, il tessuto muscolare non dovrebbe essere troppo piccolo; circa 100-200 g sarebbero sufficienti. Senza coltura pura nessun ceppo può essere per studi successivi in futuro, il che è uno svantaggio dell’utilizzo del rilevamento PCR come unico metodo.
Nei bovini infettati sperimentalmente con C. chauvoei, sono state effettuate analisi PCR su muscoli macinati e altri organi e C. chauvoei è stato rilevato in tutti gli organi testati . Pezzi di muscolo tritati da casi sospetti di blackleg sono stati testati direttamente mediante PCR e confrontati con la cultura. Il rilevamento mediante PCR ha dato risultati migliori rispetto alla coltura e all’identificazione biochimica, che è in disaccordo con i risultati del presente studio in cui solo il 12% (3 su 24) dei pezzi di sangue o muscoli era al di sopra della soglia di rilevamento della PCR, mentre il 9% dei campioni di succo di carne era al di sopra della soglia di rilevamento (Tabella 2). Le sostanze inibitorie sono probabilmente presenti nei tessuti muscolari. Inibitori per la reazione enzimatica di amplificazione PCR sono stati identificati nel fegato, milza e reni e ci possono essere inibitori simili presenti nel tessuto muscolare. I risultati dei pezzi muscolari macerati in campioni di soluzione salina fisiologica sterile (26%) non corrispondevano bene a quelli del test biochimico. La PCR diretta su tessuto muscolare o altri campioni simili probabilmente non è adatta per sostituire le fasi di coltura seguite da test biochimici o da PCR.
Campioni muscolari raccolti con tamponi
Per verificare se sia necessario inviare tessuto muscolare per l’analisi di C. chauvoei o se sia sufficiente utilizzare tamponi per la raccolta dei campioni, è stato simulato un servizio postale. Dei 22 tessuti muscolari studiati, il 64% era al di sopra della soglia di rilevazione della PCR. Per i tamponi prelevati dagli stessi campioni dopo la simulazione del servizio postale, dal 36% al 47% dei tamponi erano al di sopra della soglia di rilevamento (Tabella 3). Sarebbe più pratico prelevare campioni con tamponi invece dei tessuti muscolari se i tamponi sono sufficienti per l’analisi di C. chauvoei. Tuttavia, i tessuti muscolari hanno dato campioni più positivi rispetto ai tamponi quando entrambi sono stati analizzati mediante coltura e PCR (Tabella 3). L’incidenza di C. chauvoei sui tamponi dei casi di tessuto muscolare positivo sembrava essere casuale. Tuttavia, sembrava fare poca o nessuna differenza se i tamponi sono stati conservati per 1, 3 o 6 giorni.
Campioni provenienti da impianti di biogas
Clostridium chauvoei è stato rilevato in 3 campioni su 11 nel substrato di biogas prima della pastorizzazione, ma non è stato possibile rilevarlo dopo la pastorizzazione o dopo la digestione (Tabella 4). I batteri contenuti in questi tipi di campioni potrebbero provenire da letame o da sottoprodotti di origine animale provenienti dal macello, poiché entrambe queste fonti sono utilizzate per la produzione di biogas. Nessuna delle aziende campionate in questo studio invia il proprio letame agli impianti di biogas a causa della distanza geografica, ma gli animali vengono inviati al macello locale. Casi di blackleg sono stati segnalati anche nel bacino di utenza dell’impianto di biogas.
Dopo la lavorazione del biogas, i residui digeriti vengono utilizzati come fertilizzante. I batteri spore-formanti possono sopravvivere alla pastorizzazione e alla digestione negli impianti di biogas e i residui digeriti dagli impianti di biogas possono quindi essere in grado di diffondere blackleg in nuove aree. Tuttavia, non C. chauvoei è stato rilevato nel prodotto trasformato, quindi forse l’ambiente nel digestore non è adatto per C. chauvoei, o la flora nel digestore supera C. chauvoei. Le spore clostridiali possono sopravvivere per lunghi periodi nel suolo, che deve essere preso in considerazione in ulteriori studi su C. chauvoei in digestore.
Campioni provenienti da aziende agricole
Nonostante negli ultimi anni tutte le aziende interessate abbiano segnalato casi sospetti di blackleg, tutti i campioni di feci, suolo e insilati sono risultati negativi per C. chauvoei. Ci potrebbero essere diverse spiegazioni per questo. Le spore potrebbero essere ancora presenti nel materiale, ma al di sotto del livello di rilevamento. Inoltre, gli inibitori della PCR possono essere presenti nei campioni e la PCR può essere ostacolata . Le feci di bovini contengono acidi grassi volatili (VFA) e i campioni di terreno possono contenere tracce di metallo, entrambi noti per interferire con la reazione della PCR. Tuttavia, la fase di coltura prima della PCR riduce l’influenza delle sostanze inibitorie.
Dal C. chauvoei è un batterio del suolo alcune variazioni stagionali possono verificarsi, ad esempio forti piogge possono contribuire alla diffusione delle spore e la quantità di spore nel terreno può essere più accessibile al bestiame. La maggior parte dei campionamenti è stata effettuata all’inizio dell’autunno quando il tempo era soleggiato e quindi la concentrazione di spore nei campioni sarebbe stata bassa. Il numero di campioni potrebbe essere stato insufficiente per rilevare la contaminazione ambientale. Tuttavia, per ragioni pratiche, un numero molto elevato di campioni ambientali sono raramente disponibili sul campo.
I casi sospetti di blackleg nelle aziende si erano verificati principalmente in vitelli e giovenche, ma un’azienda ha segnalato un caso in una mucca adulta. Sette delle undici aziende agricole A-K avevano routine di vaccinazione in atto al momento del campionamento (Tabella 1).
Due delle aziende hanno immagazzinato il letame prima della diffusione e le altre no, ma nessuna delle aziende ha diffuso il letame sui pascoli. I veterinari locali hanno riferito di aver visto più casi di blackleg dopo la radura degli arbusti sull’isola di Öland, specialmente su Alvaret (una pianura calcarea sterile, lunga quasi 40 km e larga 10 km, con una flora speciale a seconda del terreno sottile e del pH elevato). Alvaret è usato solitamente come pascolo dalle aziende agricole vicine. Non molto radura arbustiva era stato fatto durante l ” anno di campionamento.
PCR
Le procedure culturali sono costose e richiedono molto tempo e la contaminazione con altri batteri anaerobici che superano il C. chauvoei causa spesso problemi . Quando si utilizza la PCR, il DNA delle cellule vitali e non vitali viene amplificato. Se solo le cellule vitali devono essere rilevate, è possibile applicare una fase di arricchimento . In questo studio la coltura su piastre FAA prima che la PCR fosse utilizzata per evitare il rilevamento di batteri non vitali e reazioni di PCR falsi positivi. Il DNA è facile da amplificare dalle colture pure, ma i problemi sorgono con i campioni contaminati, quali i campioni dai rifiuti biologici. Il rilevamento del DNA mediante PCR può essere ostacolato da numerose sostanze tra cui acidi umici, VFA, grassi e proteine . Tuttavia, la fase di coltura prima della PCR è stata utilizzata come fase di arricchimento e, pertanto, riduce l’influenza delle sostanze inibitorie. A causa della flora brulicante, nessuna purificazione dalle piastre FAA potrebbe essere fatto.
Soglia di rilevamento del metodo PCR
Il livello di rilevamento era di 200 cfu/g. Questo può sembrare un livello di rilevamento scarso, ma può essere spiegato dal fatto che campioni come letame, suolo e substrato di biogas sono fortemente contaminati dalla flora circostante. Sasaki ha riportato un livello di rilevamento di 10 cfu / g, apparentemente in campioni più puliti. Tuttavia, poiché il livello di rilevamento nel nostro studio era 200 cfu/g e poiché ci si aspettava che tali campioni contenessero un basso numero di C. chauvoei. Pertanto, il metodo utilizzato nel presente studio non è praticamente applicabile.
Aspetti ambientali
La soglia di rilevamento del metodo PCR dopo la precultura non è allo stato attuale idonea a garantire che gli animali siano indenni da infezioni o a determinare lo stato dei pascoli. Devono invece essere utilizzate le raccomandazioni attualmente applicate, poiché il metodo non può essere utilizzato come base per le routine di vaccinazione. Nelle aree in cui la gamba nera è endemica, si raccomanda la vaccinazione annuale prima del pascolo, nonostante i costi e il tempo richiesto.
Questo studio ha dato qualche indicazione che C. chauvoei non passa attraverso il processo di biogas. Il numero di C. chauvoei nei rifiuti biologici è forse diminuito nel digestore al di sotto della soglia di rilevamento del metodo e il rischio di diffusione dei residui digeriti è quindi trascurabile. Sono necessari ulteriori studi sulla sopravvivenza clostridiale attraverso il processo di biogas prima di poter trarre conclusioni definitive. Tuttavia, i vantaggi dei residui digeriti come fertilizzante forse superano il rischio di diffondere la gamba nera.
