Iniettabile umana ricombinante matrici collagene limite di rimodellamento negativo e migliorare la funzione cardiaca dopo infarto miocardico

Studio di progettazione

Qui, abbiamo condotto uno studio per (i) la progettazione clinicamente rilevanti collagene idrogel uso umano ricombinante il collagene di tipo I e di tipo III; (ii) caratterizzare e confrontare le proprietà fisiche del rHCI e rHCIII materiali; (iii) valutare il potenziale terapeutico dei materiali per il trattamento dell’IM nei topi; e (iv) identificare i meccanismi alla base degli effetti terapeutici osservati del trattamento rHC. Per gli esperimenti in vivo, la legatura dell’arteria LAD nei topi è stata scelta come modello animale clinicamente rilevante e ben consolidato di MI. Per le valutazioni funzionali, istologiche e molecolari, il numero di animali per gruppo è stato ridotto al minimo da tre a quindici topi, come specificato nelle leggende di figura. I topi sono stati assegnati in modo casuale a gruppi di trattamento e tutte le analisi sono state eseguite in cieco.

Preparazione e caratterizzazione di rHC matrici

Un 1% di collagene soluzione è stata preparata sciogliendo 0,1 g di collagene liofilizzato (rHCI e rHCIII, da Fibrogen) in 10 ml di ultra puro di ddH2O. Condroitin solfato (CS; Wako), N-etil-N-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) e N-idrossisuccinimide (NHS) sono stati aggiunti per produrre una miscela finale con un rapporto tra la massa di 1:4:0.5:0.3 collagene:CS:NHS:EDC. I materiali sono stati preparati su ghiaccio utilizzando un sistema chiuso che consente una miscelazione omogenea senza aggiungere bolle. Dopo un’accurata miscelazione, il pH è stato regolato su 7.4 di NaOH (1.0 N). Le matrici senza CS sono state preparate allo stesso modo ma con PBS aggiunto per compensare il volume di CS. Le matrici etichettate con Alexa-Fluor®594-NHS sono state preparate aggiungendo 20 µL della soluzione madre del colorante (1 mg/mL in DMSO) ai gel prima di aggiungere il NaOH (25 nmol di colorante per idrogel), seguito da 20 fasi di miscelazione.

Viscosità del materiale

Le misurazioni della viscosità sono state effettuate utilizzando un reometro Brookfield R/S plus (Brookfield) a 37 °C. Un mandrino conico C25–2/30 è stato utilizzato per comprimere il materiale (spostamento di 50 µm) su un piedistallo a temperatura controllata. La viscosità è stata misurata con un blocco di rotazione della rampa ad una velocità di 1/min unità preimpostate ad una velocità di taglio di cinque unità per un tempo di 30 min.

Grado di reticolazione

Sono stati effettuati esperimenti di calorimetria a scansione differenziale (DSC) per valutare il grado di reticolazione. In breve, le misurazioni sono state eseguite in un calorimetro a scansione differenziale Q2000 (TA Instruments) nell’intervallo da 8 a 80 °C utilizzando una velocità di scansione di 5 °C min−1. Le matrici di collagene (5-20 mg) sono state asciugate in superficie con carta da filtro e sigillate ermeticamente con un coperchio di alluminio (Tzero; TA Instruments) in una vaschetta di alluminio (Tzero; TA Instruments). La temperatura di denaturazione (Td) è stata misurata all’inizio del picco endotermico.

Contenuto di acqua

Il contenuto di acqua dei materiali è stato misurato pesando il peso umido (W0) del campione, equilibrato in PBS per 96 h a 4 °C. Il materiale è stato quindi essiccato sotto vuoto a temperatura ambiente per 96 h per ottenere la massa secca (W). Il contenuto totale di acqua degli idrogel (Wt) è stato quindi calcolato secondo l’equazione:

Degradazione

degradazione Enzimatica è stata misurata utilizzando 50-100 mg di idrogel posto in 5 ml di collagenasi di tipo I (10 U/ml in PBS) a 37 °C. Il residuo solido massa è stato misurato su un periodo di 24 h. Il tasso di degradazione è calcolata a partire dalla pendenza iniziale delle trame dei rimanenti di massa in funzione del tempo e segnalato come mg/min.

Porosità del materiale

Le misure di microscopia elettronica a scansione a bassa temperatura (Crio-SEM) sono state eseguite a -50 °C utilizzando un Tescan (modello: Vega II-XMU) dotato di un supporto per campioni a stadio freddo, un rivelatore di elettroni a retrodiffusione (BSE) e un rivelatore di elettroni secondari (SE). Le dimensioni dei pori sono state misurate da almeno 250 singole da 4 a 6 aree casuali del campione utilizzando il software ImageJ®. Il diametro dei pori è stato quantificato utilizzando l’asse longitudinale del poro utilizzando lo strumento linea retta. L’area dell’immagine è stata regolata rispetto alla barra della scala delle dimensioni ottenuta dal sistema Tescan Vega II 65.

Esperimenti sugli animali

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato per la cura degli animali dell’Università di Ottawa ed eseguite secondo la Guida dell’Istituto nazionale della salute per la cura e l’uso degli animali da laboratorio.

Il modello MI

MI è stato indotto in topi C57BL/6 femmine di 9 settimane (Charles River; numero di topi/gruppo sono nelle leggende della figura) e la consegna del trattamento è stata eseguita utilizzando un protocollo stabilito26,27. I topi sono stati anestetizzati (2% isoflurano), intubati e il cuore è stato esposto tramite quarta toracotomia intercostale. L’arteria coronaria discendente anteriore sinistra (LAD) è stata quindi legata appena sotto la sua comparsa dall’atrio sinistro. Questa procedura si traduce in un grande infarto miocardico che coinvolge le parti anterolaterale, posteriore e apicale del cuore, che è stato confermato al momento dell’intervento mediante sbiancamento miocardico nella regione fornita dall’arteria. buprenorfina a breve durata d’azione è stata somministrata almeno un’ora prima dell’intervento chirurgico e buprenorfina a lunga durata d’azione è stata somministrata per via sottocutanea immediatamente prima dell’intervento chirurgico per l’analgesia perioperatoria. A 1 settimana dopo l’infarto miocardico (basale), i topi sono stati assegnati in modo casuale a ricevere il trattamento di matrici PBS (controllo), rHCI o rHCIII, erogate in cinque iniezioni intramiocardiche equivolumetriche (10 µl per sito, 50 µl totali) attraverso un ago da 27 G utilizzando una procedura a torace chiuso a guida ecografica. La siringa è fissata in un micromanipolatore (VisualSonics) e, prima della procedura di iniezione, sia l’ago che la sonda RMV scanhead sono allineati lungo l’asse lungo del cuore. Tramite il campo visivo ad ultrasuoni, il micromanipolatore viene utilizzato per posizionare la punta dell’ago nella posizione desiderata all’interno del miocardio per la consegna delle iniezioni (vedi Fig. 1 e Video supplementare 1). I topi sono stati uccisi dall’anestesia terminale a 2 giorni o 4 settimane dopo il trattamento e i cuori sono stati raccolti per l’istologia e / o le misurazioni delle proprietà meccaniche.

Ecocardiografia

L’ecocardiografia transtoracica è stata eseguita su viste ad asse lungo utilizzando un sistema Vevo770 in modalità B con una sonda scanhead di microvisualizzazione in tempo reale serie 707B (VisualSonics). L’imaging è stato eseguito al basale prima dell’iniezione del trattamento (7 giorni dopo l’infarto miocardico) e a 28 giorni dopo l’iniezione per determinare la frazione di eiezione ventricolare sinistra (LVEF), la variazione frazionaria dell’area (FAC), il volume sistolico terminale (ESV), il volume diastolico terminale (EDV), il volume dell’ictus e la gittata cardiaca. Si noti che LVEF, ESV e EDV sono usati come predittori clinici di HF e sopravvivenza dopo MI44.

Imaging ex vivo della matrice etichettata Alexa-Fluor®594

Le matrici rHC etichettate chimicamente (25 nmol di colorante per idrogel) sono state iniettate nel cuore del topo infartuato, come descritto sopra. Gli animali sono stati uccisi a 2 h, 2 giorni e 7 giorni dopo il trattamento e i cuori sono stati raccolti e imaged ex vivo da IVIS® Spectrum (PerkinElmer) per visualizzare la distribuzione rHCI e rHCIII all’interno dei cuori (λeccitazione: 570 nm; λemission: 640 nm). Per l’istologia, le sezioni di tessuto sono state preparate in acetone e poi colorate con DAPI seguite da imaging utilizzando uno scanner per diapositive Leica Aperio Versa con un ingrandimento finale di ×20 e una pila Z con otto passaggi a 1,5 µm.

Analisi del ceppo

L’ecocardiografia transtoracica è stata eseguita su viste ad asse lungo utilizzando un sistema Vevo3100 in modalità B con una sonda scanhead di microvisualizzazione in tempo reale serie MX400 (VisualSonics). L’imaging è stato eseguito al basale prima dell’iniezione del trattamento (7 giorni dopo l’IM) e a 2 giorni dopo l’iniezione per determinare il ceppo endocardico longitudinale al momento della chiusura della valvola aortica (che rappresenta la sistole finale). Il ceppo nel segmento 5 (il segmento medio anteriore), corrispondente all’area della zona di confine mirata all’iniezione del trattamento, è stato analizzato utilizzando l’applicazione Vevostrain del software Vevo LAB 3.1.1 (VisualSonics)41. Esempi rappresentativi per le misurazioni effettuate sono inclusi nella Fig. 10 per tutti i gruppi sperimentali più un animale sano (non infartuato).

Elettrocardiografia

Gli elettrocardiogrammi sono stati ottenuti contemporaneamente all’ecocardiografia utilizzando un sistema Vevo3100 (VisualSonics) al basale prima dell’iniezione del trattamento (7 giorni dopo l’infarto miocardico) e a 2 giorni dopo l’iniezione. Gli elettrocardiogrammi sono stati esportati da Vevo LAB 3.1.1. software (VisualSonics). La lunghezza degli intervalli PR, QT e QRS è stata determinata utilizzando il software ImageJ (Tabella supplementare 1).

Proprietà meccaniche del miocardio

I topi sono stati sottoposti a eutanasia mediante anestesia terminale a 2 o 28 giorni dopo il trattamento e i cuori sono stati raccolti. Sono stati asportati pezzi rettangolari (2,5 × 5 mm) del ventricolo sinistro comprendente la cicatrice e la zona di confine. Per determinare l’elasticità a trazione del tessuto (modulo di Young), i campioni sono stati sottoposti a test meccanici in un tester universale Instron mechanical (Modello 3342, Instron) dotato di software Serie IX/S, utilizzando una velocità della traversa di 10 mm min−1.

Istologia/Immunoistochimica

Sono stati preparati vetrini di sezioni di tessuto miocardico da un sottoinsieme di cuori che non sono stati utilizzati per le misurazioni delle proprietà meccaniche. A 28 giorni dopo l’iniezione, i cuori sono stati raccolti, perfusi con PBS, incorporati in ottobre e congelati a scatto in azoto liquido. Sezioni di 10 µm sono state tagliate usando un criostato. Per valutare le dimensioni della cicatrice, le sezioni di tessuto sono state fissate in 4% PFA per 1 h e colorate con la procedura di tricromia di Masson (Sigma). Immagini scattate con un microscopio Olympus BX50 utilizzando un obiettivo 2 × e otto sezioni per mouse sono state utilizzate per misurare lo spessore della parete remota e per determinare la dimensione della cicatrice utilizzando il metodo dell’arco a metà linea utilizzando il software miquant66. Per l’immunoistochimica, le sezioni di tessuto sono state fissate in acetone per 20 min, permeabilizzate con Tritone allo 0,1% per 10 min e quindi bloccate in siero al 10% per 1 h a temperatura ambiente. Gli anticorpi primari sono stati applicati durante la notte a 4 ° C in siero al 10%, quindi i vetrini sono stati risciacquati e trattati con anticorpi secondari per 1 ora a temperatura ambiente, prima di essere montati con mezzo di montaggio fluorescente (Dako). Per il rilevamento di vasi sanguigni e miofibroblasti, PECAM-1 (noto anche come CD31; Santa Cruz 101454, 1:50) e α-SMA (Abcam 5694, 1:200) gli anticorpi sono stati utilizzati e rilevati con AF594 anti-rat (Life Technologies A11008, 1:500) e AF488 anti-rabbit (Life Technologies A11007, 1:500), rispettivamente. I macrofagi M2 sono stati rilevati dall’anticorpo anti-CD206 coniugato AF488 (Biolegend 141710, 1:50). Per la colorazione della troponina I cardiaca, le sezioni sono state incubate con agglutinina di germe di grano etichettata AF488 (ThermoFisher, W11261) per 1 h a 37 °C seguita da incubazione con anticorpo primario della troponina I cardiaca di capra (Abcam ab56357, 1:200) e rilevata dall’anticorpo secondario AF594 anti-capra di asino (Life Technologies A-11058, 1:500). Infine, per la connessina 43 colorazione, le sezioni sono state incubate con connessina 43/GJA1 (Abcam ab11370, 1:400) e troponina cardiaca I (Abcam ab188877, 1:200) primaria anticorpi seguita da rilevamento con AF488 anti-coniglio (Life Technologies A11007, 1:500) e donkey anti-capra AF594 anticorpo secondario (Tecnologie della Vita A-11058, 1:500), rispettivamente. Le immagini fluorescenti sono state ottenute utilizzando un microscopio osservatore Zeiss Axio con obiettivo ×20 e per le sezioni colorate connexin 43 è stato utilizzato uno scanner per diapositive Leica Aperio Versa con obiettivo 20×. Per tutte le macchie IHC, sono state analizzate quattro sezioni per mouse e per ciascuna sezione sono state utilizzate immagini 2-4 all’interno della zona di confine, infarto e regioni remote per l’analisi. Per la colorazione H & E, le sezioni di tessuto sono state fissate in formalina al 10%. Le sezioni sono state poi colorate prima nella soluzione di hematoxylin gill n. 2 per 7 min, seguita da differenziazione dell’alcol acido, e poi 0,5% di eosina per 7 min, seguita da disidratazione (tutte le soluzioni di Sigma). Le immagini sono state scattate con un microscopio Olympus BX50. La zona di confine è stata designata come FOV direttamente adiacente a entrambi i lati della regione dell’infarto che inizia quando il 50% del LV è tessuto cicatriziale fibrotico (vedi Fig. 11 per una rappresentazione schematica).

Esperimenti su topi Cx3cr1-EGFP

Per valutare il reclutamento di cellule mononucleate circolanti nel miocardio dopo il trattamento con rHC, i topi B6.129P-Cx3cr1 tm1Litt/J (Cx3cr1-EGFP) sono stati acquistati dal Laboratorio di Jackson. Questi topi esprimono una proteina fluorescente verde potenziata in monociti, cellule dendritiche, cellule NK e microglia cerebrale e sono un modello riportato per lo studio del reclutamento di cellule mononucleate nel cuore67. A 1 settimana dopo l’infarto miocardico, i topi hanno ricevuto un trattamento di 50 µl di PBS, rHCI o rHCIII, come descritto sopra. Gli animali sono stati uccisi 2 giorni dopo il trattamento e il sangue è stato raccolto in provette EDTA. Inoltre, i cuori sono stati perfusi con PBS e sono stati raccolti il ventricolo destro e la regione apicale del ventricolo sinistro. I tessuti sono stati risciacquati con HBSS e digeriti in 2.4U/ml dispase I (Roche) e 1 mg/ml Collagenasi B (Roche) per 40 min a 37 °C. I campioni sono stati lavati tre volte con PBS, centrifugati per 5 min a 400 g e le cellule isolate sono state preparate per la citometria a flusso (FACS Aria III; Becton Dickinson). Le cellule sono state etichettate con APC anti-mouse/uomo CD11b (Biolegend 101211), PE anti-mouse Ly-6G/6C (Biolegend 108407), PE/Cy5 anti-mouse F4/80 (Biolegend 123111), PE/Cy7 anti-mouse CD38 (Biolegend 102717) e Alexa Fluor® 700 anti-mouse CD206 (Biolegend 141733), il produttore-raccomandato diluizioni (0.25 µg/L per 1 × 106 celle per CD11b, Ly-6G/6C, CD38 e CD206 e 1 µg/L per 1 × 106 celle per F4/80). Vedi Fig. 12 per l’ordinamento/gating strategia.

Isolamento cellulare e citometria a flusso per sottoinsiemi di monociti

Due giorni dopo l’iniezione di trattamento i topi sono stati uccisi dall’inalazione di CO2 seguita da dislocazione cervicale. Il sangue è stato raccolto da topi attraverso puntura cardiaca in una soluzione di EDTA da 50 mm e gli globuli rossi sono stati lisati con tampone di lisi dei globuli rossi (RBC) secondo il protocollo del produttore (Biolegend 420301). Le cellule sono state isolate dai cuori di topo raccolti utilizzando un tampone di digestione contenente: DNasi I (50 U/µL; Sigma D5025), collagenasi di tipo II (400 U/mL; ThermoFisher 17101015), collagenasi D (0,15 U/mL; Sigma 11088866001) e ialuronidasi (10 U/mL; Sigma H3506). Dopo un’ora di digestione a 37 °C, le cellule cardiache isolate sono state fatte passare attraverso un filtro da 70 µm. Infine, gli spleens di topo raccolti sono stati schiacciati e triturati attraverso un filtro da 70 µm seguito da incubazione con tampone di lisi dei globuli rossi (RBC). Pellet di cellule sono stati raccolti per centrifugazione a ×400g per 5 min a 4 °C. Cellule isolate da tutti i tessuti sono state incubate con Zombie Aqua fissabile vitalità colorante (1:500, Biolegend 423101) per 20 min a temperatura ambiente. Successivamente, i recettori Fc sono stati bloccati con il reagente TruStain X (1: 100, Biolegend 103319) per 10 min a temperatura ambiente. Le cellule sono state poi incubate con un anticorpo cocktail per 45 min a temperatura ambiente contenente CD45-APC/Fire 750 (1:160, Biolegend 30-F11), CD11b-PE/Cy7 (1:80, Biolegend M1/70), Ly6G-PerCP/Cy5.5 (1:160, Biolegend 1A8), CD3-PE (1:160, Biolegend 17A2), B220-AF488 (1:50, Biolegend RA3-6B2), F480-AF647 (1:100, Biolegend BM8) e Ly6C-BV421 (1: 80, BD Biosciences AL-21). La citometria a flusso è stata eseguita utilizzando un BD FACS Aria III e i dati sono stati analizzati con il software FlowJo V10.5.2 (vedi Fig. 12 per l’ordinamento/gating strategia). Il numero totale di cellule vitali per ciascun tessuto dopo l’isolamento è stato determinato mediante l’esclusione del trypan blue utilizzando un emocitometro. Il numero totale di cellule all’interno di ogni popolazione leucocitaria è stato determinato utilizzando la percentuale di cellule vive per una data popolazione cellulare, e il numero totale di cellule vive contate post-isolamento che è stato poi normalizzato al mg di tessuto o mL di sangue raccolto. Strategia di gating: le singole cellule sono state gated basate su FSC-A e FSC-H. Le singole cellule vive sono state gated su bassa colorazione per Zombie Aqua live/dead dye. Da questa popolazione di cellule singole vive i leucociti erano CD45+. Sottoinsiemi di leucociti sono stati caratterizzati come segue: neutrofili CD45+CD11b+Ly6G+, Ly6C monociti bassi CD45+CD11b+Ly6G−F480−Ly6C−, Ly6C monociti alti CD45+CD11b+Ly6G−F480−Ly6C+, macrofagi CD45+CD11b+Ly6G−F480+, cellule T CD45+CD11b−Ly6G−CD3+B220− e cellule B CD45+CD11b−Ly6G−CD3−B220+. Nota per il sangue espressione F480 non è stato utilizzato nella strategia di gating. Le porte sono state impostate rispetto ai controlli isotype.

Gli studi sui cardiomiociti neonatali

I miociti ventricolari neonatali di ratto (NRVM) sono stati recentemente isolati utilizzando un protocollo consolidato68. I ventricoli sinistro raccolti da ratti Sprague-Dawley di 2 giorni (Harlan) sono stati digeriti dalla tripsina (Amersham Biosciences) e dalla collagenasi di tipo II (Worthington Biochemical). Le cellule isolate sono state ri-sospese nel mezzo M-199 (Life Technologies) integrato con 10% FBS, 19,4 mm glucosio, 2 mm l-glutammina, 2 U/ml penicillina, 0,8 µg/mL vitamina B12, 10 mm HEPES e 1 × MEM aminoacidi non essenziali (Sigma-Aldrich). Sono stati eseguiti due cicli di pre-placcatura di 60 min, durante i quali i fibroblasti cardiaci si attaccano al fondo del piatto, arricchendo così la popolazione non aderente per gli NRVM. Le cellule non aderenti (NRVM) sono state quindi seminate sulle diverse matrici di collagene in piastre a 24 pozzetti (40.000 cellule/cm2). Per il test di sopravvivenza, gli NRVM in coltura di 3 giorni sono stati sottoposti a supporti M-199 contenenti perossido di idrogeno 50 µM per 3 h, dopo di che è stato eseguito un test di etichettatura Nick-End dUTP (TUNEL) terminale deossinucleotidil transferasi e le cellule morte sono state contate in tre campi di vista casuali.

Colture cellulari

Utilizzando un protocollo stabilito, macrofagi derivati dal midollo osseo sono stati isolati da C57BL/6J mice69 di 8-12 settimane. I topi sono stati sottoposti a eutanasia per inalazione di CO2 e dislocazione cervicale, e le ossa della tibia sono state raccolte e lavate con i media per isolare il midollo osseo. L’isolato del midollo osseo è stato pipettato ripetutamente per ottenere una sospensione monocellulare, che è stata poi fatta passare attraverso un filtro cellulare. Le cellule appena isolate sono state coltivate per 1 settimana in DMEM integrato con 10% FBS, 20% L929-condizionata media, e penicillina-streptomicina, e poi ri-placcato sugli idrogel rHC per 3 giorni. Le cellule sono state raccolte dagli idrogel rHC utilizzando una soluzione salina tampone di 3 mm CaCl2 Hank contenente 250 unità di collagenasi I (Gibco). La polarizzazione dei macrofagi è stata valutata mediante citometria a flusso (FACS Aria III; Becton Dickinson) utilizzando CD86 e CD206 (Biolegend) per identificare rispettivamente i macrofagi M1 e M2. Per l’isolamento delle cellule mononucleate, il midollo osseo dalle ossa della tibia è stato raccolto come descritto sopra. Le cellule mononucleate sono state purificate mediante centrifugazione a gradiente di densità utilizzando Histopaque® (Sigma) secondo le istruzioni del produttore. Le celle sono state etichettate con 0.5 µg/ml DAPI (Sigma) per 30 min a 37 °C.

Analisi di adesione dei macrofagi

Le cellule mononucleate sono state isolate mediante lavaggio delle tibie e dei femori di topi di età compresa tra 6 e 12 settimane. Le cellule sono state purificate mediante centrifugazione a gradiente di densità utilizzando Histopaque® (Sigma) secondo le istruzioni del produttore. Le cellule mononucleate sono state contate ed etichettate con DAPI. Le cellule sono state placcate sui diversi biomateriali ad una concentrazione di 50.000 cellule / cm2 per 24 h. Le cellule sono state fissate con 4% PFA per 5 min e le cellule sono state contate. I dati sono stati espressi in relazione al controllo (pozzetti non rivestiti, cioè, TCPS) per ridurre al minimo l’effetto della variabilità delle cellule tra donatori.

Test di migrazione dei macrofagi

Le cellule mononucleate del midollo osseo sono state coltivate in DMEM integrato con 10% FBS, 20% L929-mezzo condizionato e Penna/Streptococco per 7 giorni per generare macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM) ed etichettati con DAPI, come descritto sopra. I BMDM (2 × 105) sono stati quindi ri-sospesi in EBM privi di fattori di crescita e siero e caricati nella camera superiore di una piastra Transwell (Life Technologies) rivestita con 100 µL di rHCI o rHCIII. La camera inferiore conteneva un supporto macrofagico completo come descritto sopra. Dopo 24 h, gli inserti sono stati rimossi e il numero di BMDM migrati attraverso il biomateriale è stato quantificato in cieco utilizzando un microscopio a fluorescenza Zeiss Z1. I dati sono stati espressi rispetto al controllo (pozzetti non rivestiti, cioè TCPS) per ridurre al minimo l’effetto della variabilità delle cellule tra donatori.

Analisi di polarizzazione dei macrofagi

I BMDM sono stati generati in DMEM integrato con 10% FBS, 20% L929-mezzo condizionato e Penna/streptococco per 7 giorni, come descritto sopra. Per gli esperimenti di attivazione dei macrofagi, le cellule sono state stimolate per 3 giorni con lipopolisaccaride (1 µg/ml; Sigma) più IFN-γ (50 ng/ml; Sigma) per l’attivazione di M1, o con IL-4 (20 ng/ml; Sistemi R&D) per l’attivazione di M2. L’RNA totale è stato estratto utilizzando Tri Reagente (Zymo Research), secondo il protocollo del produttore. Il cDNA di primo filamento è stato sintetizzato con Smartscribe Reverse Transcriptase (Takara Bio USA) e random hexamer primers (Fisher Scientific). I livelli di mRNA del gene target sono stati valutati mediante RT-PCR quantitativa con LightCycler 480 SYBR Green I Mastermix (Roche) e un LightCycler 480 Real-Time PCR System (Roche). Le sequenze per coppie di primer sono elencate nella tabella supplementare 2. I cambiamenti relativi nell’espressione dell’mRNA sono stati determinati dal metodo ∆ ∆ Ct, espresso come livelli relativi a 18S. I dati sono stati espressi rispetto al controllo (pozzetti non rivestiti, cioè TCPS) per ridurre al minimo l’effetto della variabilità delle cellule tra donatori.

Sopravvivenza dopo esposizione a H2O2

Le cellule sono state coltivate per 7 giorni in DMEM integrato con 10% FBS, 20% L929-condizionata mezzo, e Penna/streptococco. Il giorno 7, il supporto è stato cambiato in DMEM contenente perossido di idrogeno da 0,5 mm e le cellule sono state coltivate per 3 h prima di essere colorate con 7-AAD per l’analisi mediante citometria a flusso. I dati sono stati espressi rispetto al controllo (pozzetti non rivestiti, cioè TCPS) per ridurre al minimo l’effetto della variabilità delle cellule tra donatori.

Analisi statistica

L’analisi statistica è stata eseguita utilizzando Kaleida Graph 4.5®. Tutti i dati sono presentati come media ± SEM. Per il confronto dei dati in vivo tra i trattamenti, è stata utilizzata un’ANOVA seguita dalla correzione di Holm per confronti multipli. La dimensione della cicatrice è stata analizzata usando una regressione multipla, incluso il gruppo di trattamento (rHCI, rHCIII e PBS) e LVEF basale. rHCI e rHCIII rispetto alla PBS erano predittori significativi della dimensione dell’infarto, oltre alla LVEF basale. Il coefficiente di correlazione per il modello è 0.6 utilizzando STATA regressione lineare multipla. In vitro NRVM, macrofagi e fibroblasti cardiaci sono stati analizzati sia da un test t di uno studente o da un ANOVA unidirezionale con correzione di un Holm per confronti multipli, come specificato nelle leggende di figura.

Reporting summary

Ulteriori informazioni sul design della ricerca sono disponibili nel Reporting Summary di Nature Research collegato a questo articolo.