La deplezione dei macrofagi da parte dei liposomi contenenti clodronato Riduce la formazione neointimale dopo lesione a palloncino in ratti e conigli

Le cellule infiammatorie svolgono un ruolo importante nella riparazione vascolare, reclutate immediatamente dopo la lesione.1,2 L’infiltrazione dei macrofagi nel tessuto aterectomia e lo stato di attivazione dei monociti del sangue sono correlati con un aumento del tasso di restenosi.3,4 Gli effetti dei macrofagi nella restenosi sono probabilmente causati dalla loro capacità di esprimere numerosi fattori di crescita, citochine ed enzimi che contribuiscono allo sviluppo della restenosi.5 Pertanto, abbiamo ipotizzato che l’inattivazione sistemica di monociti e macrofagi possa portare all’attenuazione della formazione neointimale e che i macrofagi svolgano un ruolo fondamentale nella patogenesi della restenosi.

La deplezione dei macrofagi può essere ottenuta con l’iniezione sistemica di liposomi contenenti clodronato.6 Clodronato appartiene alla famiglia dei bifosfonati (BPs), agenti ossei che sono potenti inibitori degli osteoclasti. Come altri BPs, il clodronato ha una scarsa permeabilità della membrana cellulare.7 I liposomi sono prontamente assorbiti dalle cellule del sistema reticoloendoteliale, in particolare dai macrofagi. La consegna liposoma-mediata del clodronato inattiva ed uccide i macrofagi dopo phagocytosis8 efficace ma non è tossica alle cellule nonphagocytic.6

Metodi

Liposomi

Clodronato (Sifavitor) e rodamina RE (Avanti Lipidi Polari) sono stati incapsulati in liposomi composto per il 50 µmol/L distearoyl-phosphatidylglycerol (DSPG) (Avanti), 100 µmol/L di colesterolo (Sigma Chemicals), e 150 µmol/L di 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) (Avanti) da inversione di fase tecnica di evaporazione, come descritto altrove.9 La dimensione media dei liposomi era 190±18 nm, 24,5 mmol/L e 20 mmol/L, clodronato e lipidi, rispettivamente.

La convalida dell’attività biologica LC è stata determinata su cellule grezze 264 simili a macrofagi. Il clodronato LC ma non libero ha ridotto significativamente il numero e la proliferazione di cellule vitali in modo dose-dipendente e non ha influenzato la vitalità e la proliferazione delle cellule muscolari lisce (SMC) o delle cellule endoteliali (CE) a concentrazioni fino a 500 µmol/L (dati non mostrati), in accordo con i dati pubblicati.8,10

Coniglio Modello

Nuova Zelanda Conigli bianchi (Harlan Laboratories, Gerusalemme, Israele) del peso di 2,5 a 3.5 kg sono stati utilizzati in conformità con le linee guida per la cura degli animali dell’Università ebraica di Gerusalemme e del National Institutes of Health (USA). Gli animali sono stati nutriti con una dieta aterogenica di 2% di colesterolo e 6% di olio di arachidi, iniziando 30 giorni prima dell’angioplastica. È stata accertata l’ipercolesterolemia (colesterolo plasmatico >1200 mg/dL). Gli animali sono stati anestetizzati da xilazina (7 mg/kg) e ketamina (40 mg/kg). Sono state somministrate eparina (200 U/kg), atropina (0,05 mg) e norfloxacina nicotinato (70 mg). La lesione del palloncino è stata eseguita sull’arteria carotide comune sinistra con un catetere a palloncino angioplastica da 3 mm (Cordis, inflazione 2×1 minuto a 8 atm). Gli animali sono stati assegnati in modo casuale a clodronato liposomiale o libero per via endovenosa (15 mg/kg), liposomi vuoti o tampone. Un investigatore accecato al tipo di gruppo sperimentale ha eseguito gli esperimenti. Dopo l’eutanasia con pentothal, le arterie sono state fissate in situ con perfusione con 150 ml di soluzione di formaldeide al 4% (pH 7.4), elaborato per l’analisi morfometrica, e macchiato con Verhoeff elastina colorazione, Mayer ematossilina ed eosina, e modificato Movat pentachrome.

Modello di ratto

Sono stati utilizzati ratti Sabra maschi (Harlan Laboratories), del peso di 350-420 g. Il modello di lesione carotidea del ratto è stato eseguito come descritto in precedenza.11,12 Clodronato liposomiale (15 mg / kg) è stato iniettato nei giorni -1 e +6. Gli organi sono stati raccolti il giorno 14 e trattati come descritto sopra.

Analisi morfometrica

Da otto a 10 sezioni in ciascuna diapositiva sono state analizzate mediante analisi morfometrica computerizzata (immagine NIH) da uno sperimentatore cieco al tipo del gruppo sperimentale. La sezione con il più grande restringimento luminale di neointima è stata analizzata come descritto in precedenza.11 Sono stati misurati direttamente il lume residuo, l’area delimitata dalla lamina elastica interna (lume originale) e l’area circoscritta dalla lamina elastica esterna (area arteriosa totale). Il grado di ispessimento neointimale è stato espresso come rapporto tra l’area della neointima e il lume originale (% stenosi) e come rapporto tra l’area neointimale e l’area dei media (N/M). Il grado di rimodellamento, costrittivo (negativo) ed espansivo (positivo) e rapporto di rimodellamento (RR) è stato stimato confrontando il rapporto tra l’area arteriosa totale del segmento danneggiato dal palloncino con quello di un segmento di riferimento adiacente e non ferito.

Citometria a flusso

Il sangue anticoagulato (200 µL) è stato incubato per 30 minuti (4°C, al buio) con anti-CD14 coniugato RPE-umano del topo (DAKO). La soluzione di lisatura FACS (diluizione 1:20) è stata aggiunta per 15 minuti. Le cellule residue sono state lavate (×1500 giri / min, 5 minuti, 4°C) in mezzo FACS (PBS, 1% BSA, 0,02% sodio azide) e sospese in mezzo FACS da 1 mL per citometria a flusso. I monociti sono stati identificati in base alla loro dimensione relativa, alla dispersione laterale e alla fluorescenza.

Distribuzione dei liposomi

I conigli sono stati iniettati con liposomi marcati con rodamina (0,4 mg/kg) e LC o tampone al giorno -1 e eutanasia ai giorni +1 e +6. I monociti del sangue sono stati separati con l’uso di un gradiente di Ficoll (Sigma) e centrifugazione (×1500 RPM, 5 minuti). I tessuti raccolti sono stati risciacquati in soluzione salina; le sezioni sono state montate su vetrini e osservate con microscopia confocale (Zeiss LSM 410).

Immunoistochimica

I campioni espiantati sono stati asportati dopo una breve perfusione salina e immediatamente congelati nel composto OCT per la criosezione (Ted Pella, Inc). I vetrini sono stati deparaffinizzati, incubati con l ‘ 1% di H2O2 in metanolo (10 minuti) per bloccare la perossidasi endogena e poi con il 10% di siero di cavallo PBS per (20 minuti). Gli anticorpi primari per coniglio RAM-11 (DAKO) o PCNA (PC10, DAKO) sono stati applicati per 1 ora a 37°C. Le sezioni sono state poi lavate con PBS seguito da anticorpo secondario biotinilato (IgG del anti-topo del cavallo, laboratorio di vettore) e da un complesso di avidina-biotina-perossidasi (corredo dell’elite di ABC, laboratorio di vettore) per 30 minuti ciascuno. Lo sviluppo del colore è stato ottenuto mediante esposizione di 5 minuti a 3,3 ‘ – diamminobenzidina tetraidrocloruro (substrato perossidasi DAB, Sigma Chemical Co) in presenza di substrato perossidasi (Sigma). Le diapositive sono state leggermente contrastate con Gill No. 3 hematoxylin (Sigma). La colorazione positiva è stata valutata al microscopio (Olympus, BX40) a 2×/0,25 10×/0.25 ingrandimenti e fotogrammi video digitalizzati. La prevalenza dei macrofagi è stata valutata come l’area percentuale media occupata da cellule colorate positivamente in 5-6 campi ad alta potenza.

Produzione e trascrizione di IL-1β

Gruppi separati di animali sono stati utilizzati per questi studi. Arterie e fegati sono stati omogeneizzati nel buffer di collagenasi e IL-1β estratto è stato misurato utilizzando kit ELISA commerciali (sistemi R&D).

Per l’analisi della reazione a catena della trascrizione–polimerasi inversa (RT-PCR), l’RNA dalle arterie carotidi è stato estratto con l’uso di un kit di isolamento dell’RNA (Life Technologies). La qualità, la dimensione e la quantità di RNA sono state esaminate e i valori delle bande sono stati normalizzati all’espressione di mRNA β-actina.13

Attività della metalloproteinasi-2 della matrice

Il surnatante dell’omogenato delle arterie nel buffer della collagenasi è stato analizzato per l’attività della collagenasi. I campioni sono stati separati su impregnati di gelatina (1 mg / mL: Difco) SPS 8% gel di poliacrilammide in condizioni non riducenti, agitati 30 minuti in 2,5% Triton X-100 (BDH), incubati in tampone collagenasi (16 ore, 37°C) e colorati con 0,5% Coomassie G 250 (BioRad) in metanolo/acido acetico/H2O (30:10:60). L’intensità della banda è stata determinata dalla densitometria computerizzata (dinamica molecolare tipo 300A).

Statistiche

I dati sono espressi come media±SD. I confronti dei risultati istologici tra il gruppo di controllo e il gruppo di trattamento sono stati effettuati dal test t dello studente spaiato. I confronti dei monociti del sangue e delle citochine nel tempo sono stati effettuati con l’analisi ANOVA a 2 vie. Le differenze sono state definite statisticamente significative a P < 0,05.

Risultati

Prevenzione dell’iperplasia postangioplastica

Massiccia proliferazione di SMCS e formazione di matrici extracellulari è stata osservata negli animali di controllo dopo lesioni a palloncino (Figura 1, a e b). Non sono state riscontrate differenze significative tra il trattamento con liposomi vuoti, soluzione salina o clodronato libero in soluzione (risultati raggruppati come controlli). Il rapporto N / M era di 1,4±0,44 (Figura 1e) e la stenosi luminale era del 75±8%. LC (15 mg / kg, giorni -1 e +6) ridotto rapporto N/M a 0,66±0,2 (Figura 1,c, d ed e) e stenosi luminale a 41±8%. Lieve rimodellamento espansiva si è verificato in entrambi i controlli (RR=1. 22±0,24) e animali trattati con LC(RR = 1,29±0,25). L’area mediale, la morfologia ossea e la composizione minerale non sono state influenzate dal trattamento con LC (dati non mostrati). Non sono state osservate infezioni palesi e nessun effetto collaterale sistemico rilevabile.

Per accertare l’effetto della deplezione dei macrofagi in un modello animale non iper-colesterolemico (senza cellule schiumose) è stato utilizzato il modello di lesione carotidea del ratto.11 La marcata neointima è stata soppressa dal trattamento con LC, senza variazioni significative nell’area arteriosa mediale e totale (Tabella).

Meccanismo di Azione

Riduzione di Sangue Monociti e Macrofagi dei Tessuti

Baseline monociti livello era di 2,8±0.5% di globuli bianchi (WBC). Prima dell’intervento chirurgico, 24 ore dopo l’iniezione di LC, i monociti sono stati drasticamente ridotti a <0,2% del WBC totale (Figura 2,a e b), mentre la conta dei WBC è rimasta invariata. Tre giorni dopo l’intervento chirurgico, i monociti ematici sono stati lievemente aumentati al 3,5±0,4% negli animali di controllo e allo 0,7±0,7% negli animali trattati con LC, tornando ai livelli basali dopo 6 giorni (Figura 2c).

I macrofagi del fegato e della milza sono stati ridotti dalla colorazione LC (RAM 11) 6 giorni dopo l’infortunio (Figura 3). L’area macchiata positivamente nel fegato è stata significativamente ridotta da 21,5±4% a 14,7±2,9% e nella milza da 33,3±1,5% a 11,4±3% rispettivamente nei conigli di controllo e trattati con LC. Allo stesso modo, è stata osservata una diminuzione della colorazione arteriosa RAM-11 per i macrofagi nei conigli trattati con LC 3 e 6 giorni dopo l’infortunio (Figura 4).

La riduzione di monociti e macrofagi è stata rilevata anche mediante iniezione di liposomi fluorescenti (FL). Una marcata riduzione del segnale fluorescente è stata osservata nei monociti del sangue (così come nel numero ridotto) e nel fegato e nella milza degli animali trattati con LC (Figura 5). FL sono stati rilevati in feriti ma non in arterie intatte. La somministrazione concomitante di FL con LC ha ridotto significativamente il segnale fluorescente nella parete arteriosa lesa (Figura 5).

PCNA, IL-1β e Matrice Metalloproteinasi-2

L’area macchiata positivamente per PCNA a 6 giorni dalla lesione è stata significativamente ridotta dal 5,6±2,6% negli animali di controllo all ‘ 1,7±1,3% nei conigli trattati con LC (Figura 6, a e b). Neointima è stata osservata a malapena in questo momento iniziale in cui la proliferazione di SMC è massima.

L’analisi dei livelli di IL-1β nel tessuto arterioso dopo la lesione ha rivelato un pattern a forma di campana con un picco a 6 giorni dopo la lesione e il ritorno ai livelli basali dopo 30 giorni (Figura 7a), e una significativa diminuzione dei livelli di IL-1β è stata osservata dopo 3 e 6 giorni negli animali trattati con LC. Negli animali di controllo, la trascrizione dell’mRNA IL-1β era più forte al giorno 3 rispetto all’espressione più debole 1 giorno dopo la lesione, ma entrambi erano significativamente ridotti dal trattamento con LC (Figura 7b). Anche i livelli di IL-1β nel fegato sono stati ridotti dopo una singola iniezione di LC al giorno -1, inclinando a livelli basali a 30 giorni (dati non mostrati).

L’attività della metalloproteinasi della matrice arteriosa (MMP-2) è aumentata dopo l’infortunio, esibendo un pattern a forma di campana con un picco a 6 giorni (292±46) e tornando ai livelli basali a 14 giorni (Figura 7c). LC ha significativamente alleviato l’attività MMP-2 e al giorno 6 era solo 52±17.

Discussione

Questo studio mostra per la prima volta che l’inattivazione dei macrofagi mediante somministrazione sistemica di clodronato incapsulato in liposomi inibisce la perdita di luminale dopo lesioni a palloncino sia nei ratti che nei conigli ipercolesterolemici. Questi risultati convalidano la nostra ipotesi che i macrofagi svolgono un ruolo fondamentale nella patogenesi delle arteriopatie accelerate. L ‘aumento osservato dell’ area luminale è stato ottenuto principalmente attraverso la riduzione dell ‘ iperplasia neointimale. È stato anche dimostrato un lieve aumento del rimodellamento espansivo, ma il suo contributo alla differenza nell’area luminale è stato minimo.

Il clodronato appartiene alla famiglia dei BPs, farmaci usati clinicamente nei disturbi correlati alle ossa, inclusa l’osteoporosi. Essendo altamente idrofili e caricati negativamente, i BPS liberi sono quasi incapaci di attraversare le membrane cellulari.7 L’assorbimento della PA da parte degli osteoclasti che riassorbono l’osso (originati come macrofagi dai monociti del sangue) si verifica quando le cellule inghiottono l’osso rivestito di droga.7 Né il clodronato libero né il LC hanno inibito la proliferazione di SMC o EC o la formazione neointimale. L’endocitosi efficace e selettiva del clodronato nei macrofagi si ottiene incapsulando il clodronato nei liposomi.9,10,14 Dopo la fagocitosi, l’azione lisosomiale interrompe i doppi strati grassi del liposoma e il clodronato libero viene rilasciato nella cellula, causando danni funzionali irreversibili e apoptosi.8,15

La somministrazione di LC ha probabilmente interrotto la risposta di fase iniziale alla lesione, mediata dalla migrazione dei macrofagi in risposta all’espressione di MCP-1.16 Iniezione di LC prima dell’infortunio monociti sangue bruscamente impoverito (Figura 2) e il numero di macrofagi e l’attività nel fegato, milza, e parete arteriosa feriti (Figure 3, 4, e 5). La riduzione dei monociti disponibili al momento della lesione ha ridotto l’iperplasia intimale, forse simile agli effetti osservati con la disattivazione dei monociti ematici da parte di IL-10.17 Bloccando la migrazione di monociti/macrofagi verso il vaso leso dal lume e/o dall’avventizia (Figura 5) ha impedito gli effetti di queste cellule sulla migrazione e sulla proliferazione di SMC.

I livelli di IL-1β e MMP-2 sono stati ridotti nei segmenti arteriosi feriti dopo il trattamento con LC. Questi principali prodotti di macrofagi attivati, secreti dopo lesioni arteriose, contribuiscono al processo di proliferazione neointimale.18-20 Ridotta proliferazione SMC può anche contribuire alla riduzione di IL-1β e MMP-2.21 Tuttavia, poiché LC non influenzano SMCs ed ECs e non hanno alcun effetto sui fibroblasti,9 il macrofago è probabilmente l’obiettivo primario per LC. L’inibizione di iperplasia intimale nel modello del ratto, senza le cellule della schiuma nell’arteria, più ulteriormente sostiene l’esaurimento sistemico dei macrofagi come il meccanismo che guida la proliferazione ridotta di SMC e la formazione neointimale. Presi insieme, questo effetto immunomodulatore e antinfiammatorio sistemico transitorio ha ridotto la migrazione e la proliferazione di SMC e la restenosi arteriosa.

I nostri risultati sono in concomitanza con gli effetti benefici osservati dopo la modulazione della funzione dei macrofagi con varie modalità. La riduzione della formazione di neointima dopo l’infortunio è stata raggiunta nei conigli mediante il blocco di Mac-122 e nei topi con deficit di Mac-1.23 Pertanto, in accordo con i recenti rapporti, 9,17,22,23 il processo infiammatorio svolge un ruolo fondamentale nella cascata della formazione di neointima. La deplezione dei macrofagi riduce anche l’iperplasia degli innesti venosi.24 Nonostante la diversa patologia in termini di innesco, vaso interessato, la placca sottostante nell’arteria angioplasticata, composizione del tessuto stenotico e durata del processo, l’effetto positivo nel modello di innesto venoso suggerisce un ruolo comune dei macrofagi nella stimolazione dell’iperplasia intimale vascolare.

Implicazioni e limitazioni

Il clodronato libero non permea le cellule e ha una breve emivita nella circolazione sistemica.6 Il clodronato che fuoriesce dai macrofagi morti e dai liposomi non si accumula in misura significativa in tessuti diversi dall’osso. Non è stato osservato alcun effetto sulla crescita somatica o sul contenuto di minerali sierici dopo il trattamento con LC, poiché il risultato della formulazione liposomiale, come con la maggior parte degli altri liposomi e sistemi di somministrazione di particolato, era nel sistema reticoloendoteliale. Inoltre, due iniezioni di 15 mg/kg di clodronato libero non dovrebbero avere alcun effetto sull’osso normale.25

L’inattivazione dei macrofagi comporta il pericolo di immunosoppressione e infezione. Tuttavia, come negli studi su mice26 e ratti carenti di Mac-1, 24 nel nostro studio non è stata osservata alcuna infezione palese con deplezione transitoria dei macrofagi. I monociti ematici si sono completamente ripresi in questo studio 6 giorni dopo l’iniezione e le concentrazioni di IL-1β sono tornate ai livelli basali. Altri hanno dimostrato che il recupero della funzione dei macrofagi da 4 a 6 giorni dopo l’esaurimento indotto da LC non induce effetti tossici a lungo termine.6,14 Le implicazioni cliniche della deplezione transitoria e parziale di macrofagi epatici e splenici con LC sistemica devono essere ulteriormente esaminate negli studi sull’uomo.

Un gran numero di segnalazioni di tentativi farmacologici di inibire l’iperplasia intimale negli animali non sono stati tradotti in una successiva inibizione della restenosi nell’uomo. L’attuale studio utilizza LC come strumento investigativo per chiarire il ruolo dell’infiammazione nella riparazione vascolare e il possibile valore di modulare l’immunità innata nella riduzione dell’iperplasia intimale postinjury. Che il beneficio sia stato osservato in due modelli animali, il ratto e il coniglio ipercolesterolemico, con lesioni disparate e diversi gradi di infiammazione, supporta il ruolo principale dei monociti e dei macrofagi nella riparazione vascolare e aumenta il valore predittivo per l’inibizione della restenosi nell’uomo.

Aree ricche di macrofagi sono prevalenti nelle lesioni aterosclerotiche di pazienti con angina instabile e infarto miocardico acuto,3 e macrofagi probabilmente mediano la rottura della placca aterosclerotica e l’insorgenza improvvisa di sindromi coronariche acute.27 Ulteriori studi sono giustificati per esaminare se la deplezione dei macrofagi da parte dei bifosfonati liposomiali possa conferire una strategia per stabilizzare altre vasculopatie e cardiomiopatie mediate dall’infiammazione, comprese le sindromi coronariche acute.

In conclusione, la somministrazione di LC ha inibito la proliferazione neointimale dopo lesioni a palloncino nel ratto e nei modelli di coniglio ipercolesterolemici. Il meccanismo suggerito è la modulazione selettiva sistemica e transitoria dell’attività dei monociti/macrofagi. I macrofagi, sebbene relativamente magri nel tessuto neointimale, svolgono un ruolo importante nel processo di proliferazione neointimale. Pertanto, la modulazione precoce e l’inattivazione dei macrofagi per 1 settimana dopo l’infortunio riducono significativamente il restringimento arterioso postangioplastico in un secondo momento.

Note