la Diagnosi di infiammazione e infezione nel sistema urinario via proteomica

sorgenti di Campionamento per valutare urinario dati di proteomica per l’urina scopi diagnostici

La collezione di 120 campioni di urina profilato in questo studio non si è limitato alla diagnosi, la valutazione della progressione o il trattamento di una determinata malattia. L’analisi delle urine (UA) dei campioni è stata ordinata dai medici curanti per vari motivi, tra cui lesioni acute, sanguinamento vaginale, vertigini/nausea, iperlipidemia, diabete di tipo II e complicanze associate, dolore addominale/nausea, ipertensione non specificata, ipertensione vescicale, poliuria idiopatica e sospetta UTI. Poiché l’UTI è una malattia infettiva altamente prevalente legata ad alcuni dei suddetti sintomi clinici (ad esempio, dolore addominale/nausea) e fattori di rischio (ad esempio, diabete), ci aspettavamo una diagnosi frequente di batteriuria o UTI da questi campioni. Le analisi proteomiche sono state limitate a campioni in cui i rapporti di analisi delle urine hanno fornito un supporto provvisorio per UTI causate da batteri (vedere Metodi). Non abbiamo analizzato campioni di urina nei casi in cui è stata resa disponibile la diagnosi specifica di batteriuria asintomatica. Sono stati ottenuti ampi dati UA per tutti i 120 campioni. Ciò includeva test con astina di livello, esame microscopico dei sedimenti urinari per vari tipi di cellule e muco e – nel 46% dei casi – dati sulla coltura dell’urina (UC). Sono stati anche esaminati i dati sull’aspetto delle urine come torbidità, colore e colore e volume del pellet di urina. I risultati delle analisi delle urine hanno permesso un confronto completo dei metodi convenzionali per diagnosticare le malattie del tratto urinario con i dati delle indagini metaproteomiche (file aggiuntivo 3: Tabella A3).

I neutrofili, gli effettori dominanti delle risposte immunitarie innate nel tratto urinario, rappresentano alti livelli di infiammazione in molti campioni

I dati proteomici hanno fornito una forte evidenza per l’importante ruolo dei neutrofili come effettori e messaggeri dell’infiammazione nel tratto urinario. I neutrofili rilasciano molecole antimicrobiche e infiammatorie dai granuli secretori che producono e uccidono gli agenti patogeni invasori nei fagolisosomi dopo la loro fagocitosi. Un’analisi gerarchica di clustering ottimizzata per l’ordine delle foglie del campione (HCLSO) ha identificato quattro cluster di campioni con profili di abbondanza proteica umana dominati da neutrofili (23 casi su 111; cluster NAD1 in Figura 1) e due cluster con quantità proteiche specifiche dei neutrofili paragonabili a quelle associate al citoscheletro (25 casi; cluster NAD2 in Figura 1). Le proteine citoscheletriche sono altamente espresse nelle cellule epiteliali che rivestono il tratto urogenitale e costituiscono la maggior parte del proteoma del sedimento urinario in assenza di condizioni fisiopatologiche nel tratto urinario. Trentacinque dei 48 profili di cluster NAD erano positivi per ID di un uropatogeno incluso G. vaginalis, indicativo del fatto che una ragione dominante per l’infiammazione nei rispettivi pazienti era la batteriuria e una risposta immunitaria nei confronti dei microbi invasori. La ragione delle distanze tra i cluster NAD nell’albero di collegamento è stata la notevole variazione del numero di proteine umane identificate che vanno da 200 a 1.500 ID per campione.

Analisi gerarchica di clustering di profili proteomici di pellet urinario per 110 campioni. Il clustering gerarchico è stato eseguito su set di dati quantitativi di proteine umane utilizzando il metodo TPA nel software MaxQuant. I set di dati sono stati sottoposti all’analisi di correlazione di Pearson con ottimizzazione dell’ordine delle foglie del campione e clustering completo del collegamento utilizzando lo strumento software MeV . Abbiamo eliminato la mappa termica dell’abbondanza proteica dall’albero gerarchico visualizzato dei campioni UP. La parte inferiore del pannello sul lato sinistro si collega alla parte superiore del pannello sul lato destro per quanto riguarda i collegamenti ad albero. I nomi dei cluster di esempio, mostrati all’estrema destra del grafico con i loro acronimi, sono discussi in dettaglio nel testo. Le barre colorate indicano il tipo, la dimensione e la posizione di ciascun cluster di campioni nell’albero.

Le abbondanze proteiche dei neutrofili derivate dai dati proteomici si correlano bene con le attività LE e la conta dei leucociti

Una motivazione chiave per questo studio è stata quella di determinare come i dati proteomici derivati dai sedimenti urinari rispetto ai saggi convenzionali per quantificare i livelli di infiammazione nei campioni di urina. Abbiamo determinato le quantità di 35 proteine note per essere altamente espresse nei neutrofili attivati (file aggiuntivo 2: Tabella A2) rispetto all’abbondanza totale di proteine per ciascun campione UP, come mostrato nei segmenti di barra blu del grafico visualizzato in Figura 2. Non inaspettatamente, l ‘ 85% per cento dei casi appartenenti ai suddetti cluster NAD1 si trovava nella sezione del grafico con un contenuto proteico neutrofilo superiore al 30% (sul lato sinistro). Le 35 proteine includevano cinque gruppi funzionali: le proteine della famiglia S100 che legano il calcio S100-A8, S100-A9 e S100-A12 che contribuiscono al 40-50% del contenuto proteico citosolico totale nei neutrofili; proteine rilasciate durante l’infiammazione da granuli dei neutrofili, tra cui la mieloperossidasi (MPO), catepsina G (CTSG), defensina-1 (DEFA1), l’elastasi (ELANE), lisosoma (LYZ), lactotransferrin (LTF), e cathelicidin (CAMP) ; proteine implicate nella formazione, il traffico, e la fusione dei granuli con phagolysosomes, tra cui grancalcin (GCA), plastina-2 (LCP1), annexin A3 (ANXA3), e tetraspanin (CD63 antigene); le proteine che influenzano la migrazione dei neutrofili nell’ambito di una riorganizzazione della matrice extracellulare, come integrina aM/β2, gelatinasi (MMP9), e neutrofili collagenasi (MMP8); e NADPH ossidasi, un enzima con subunità multiple incluso il citocromo b-245 (CYBA, Figura 3) situato nella membrana dei fagolisosomi delle cellule fagocitiche e responsabile dello scoppio ossidativo che uccide direttamente gli agenti patogeni. Molte di queste proteine, in particolare defensin-1, erano molto abbondanti in campioni con evidenza di UTI (ad esempio, SA_112 e PM_20, Figura 3). I patogeni batterici nei due casi erano S. aureus (SA) e P. mirabilis (PM) e, non inaspettatamente, si trovavano sul lato sinistro nella trama della Figura 2 e adiacenti l’uno all’altro in un cluster NAD1 (Figura 1). Riconosciamo che questi dati riflettono quantità approssimative di neutrofili considerando il fatto che proteine come defensin-1, LTF, S100-A8 e S100-A9 vengono rilasciate anche nel tratto urinario dalle cellule uroteliali. Tuttavia, l’analisi gerarchica di clustering ottimizzata per l’ordine delle foglie proteiche (HCLPO) ha mostrato che queste proteine si sono raggruppate l’una con l’altra, supportando la nozione di un ruolo dominante dei neutrofili nella loro produzione (File aggiuntivo 4: Figura A1). La perossidasi eosinofila (EPX) e la proteina cationica eosinofila (ECP) che sono anche effettori della risposta verso gli agenti patogeni erano un ordine di grandezza meno abbondante delle proteine derivate dai neutrofili, quindi non supportando un ruolo importante degli eosinofili nella risposta infiammatoria. Il fattore inibitorio della migrazione specifica dei macrofagi (MIF) era presente in quantità ancora inferiori, suggerendo la quasi assenza di macrofagi come partecipanti alle risposte immunitarie acute dopo l’invasione dei patogeni nel tratto urinario.

Profili proteici che mostrano contributi quantitativi dei neutrofili, del sistema del complemento e degli eritrociti al proteoma totale dei campioni di pellet urinario. Il grafico mostra le abbondanze proteiche sommate, relative al proteoma totale, per tre categorie di proteine biologiche. L’asse x elenca gli identificatori dei campioni UP associati a 110 soggetti umani. Le tre categorie rappresentano proteine prodotte dai neutrofili attivati (BLU), proteine altamente espresse negli eritrociti e rilasciate dopo lesioni vascolari (VERDE) e proteine associate all’attività del sistema del complemento e alla coagulazione (ROSSO). Il metodo utilizzato per la quantificazione di tutte le proteine è il metodo iBAQ nello strumento software MaxQuant. L’ordine dei campioni si basa sull’abbondanza di proteine dei neutrofili, diminuendo da sinistra a destra. Per consentire confronti diretti per la valutazione dell’infiammazione, il punteggio per il saggio LE è stato incluso nel grafico sopra ogni barra che rappresenta un campione. Sotto l’asse x, una barra aggiuntiva descrive quali campioni sono stati associati all’ID di un agente patogeno che causa UTI (segmenti di colore ARANCIONE), batteri commensali (segmenti di colore VERDE) o mancanza di ID batterici (nessun colore).

Abbondanza di proteine neutrofili selezionate nei campioni UP. Tredici proteine elencate nella legenda all’estrema destra sono proteine del granello dei neutrofili. Altre tre proteine sono fibrinogeno-β (FGB; implicato nella coagulazione), emoglobina α-subunità (HBA1; indicativa di lesioni vascolari), e uromodulina (UMOD; abbondante nelle urine di donatori sani). I campioni SA_112 e PM_20 rappresentavano UTIs causati da S. aureus (SA) e P. mirabilis (PM), rispettivamente. Il profilo di LG_23 (Lactobacillus) indicava la mancanza di infiammazione e rappresentava la colonizzazione uretrale, possibilmente anche una minore contaminazione vaginale del campione di urina. KP_10 (K. pneumoniae) sembrava rappresentare infezione vaginale come sanguinamento vaginale è stato clinicamente diagnosticato per il paziente. I profili proteici di EC_13 (UPEC) e KP_55 hanno suggerito la quasi assenza di infiammazione e quindi molto probabilmente la colonizzazione uretrale. Le proteine sono state quantificate utilizzando il metodo iBAQ, in ogni caso diviso per i valori di iBAQ sommati per l’intero proteoma UP.

Punteggio NAD

La rappresentazione delle quantità di proteine dei neutrofili nel grafico della Figura 2 è derivata dai punteggi NAD (neutrophil activation and degranulation) forniti anche in (File aggiuntivo 3: Tabella A3). La figura 2 include punteggi LE che vanno da negativo (N) a traccia (T), 1, 2 e 3 per ciascun campione. Nel complesso, si osserva una forte correlazione tra abbondanze di proteine neutrofile e punteggi LE. Il punteggio LE misura l’attività dell’esterasi leucocitaria, che probabilmente rappresenta principalmente elastasi (ELANE) e mieloblastina (PRTN3), due proteasi neutrofile quantificate per otto campioni in Figura 3. Tutti i profili sul lato sinistro del grafico (Figura 2) e cinquantatré dei 60 campioni con un contenuto proteico neutrofilo superiore al 30% (iBAQ) avevano punteggi LE di 2 o 3. Ventinove dei 40 campioni con un contenuto proteico dei neutrofili inferiore al 23% (iBAQ) avevano punteggi LE che andavano da negativi a 1. Solo in quattro degli undici casi in cui il punteggio LE era ≥ 2, ma il contenuto proteico dei neutrofili era relativamente basso, la conta microscopica dei leucociti era superiore a 11 cellule per campo ad alta potenza (HPF), una soglia utilizzata per definire la piuria. Nel complesso, c’è stato un po ‘ meno accordo nel confronto della conta leucocitaria che fissa la soglia a 11 cellule / HPF con più del 30% (iBAQ) di contenuto proteico dei neutrofili: 14 dei 60 casi avevano conteggi ≤ 10 (File aggiuntivo 3: Tabella A3). In sintesi, la valutazione del contenuto di neutrofili nei sedimenti urinari tramite proteomica sembra essere almeno accurata quanto il saggio LE per diagnosticare l’infiammazione delle vie urinarie. Misura la somma delle abbondanze di 35 proteine arricchite nei neutrofili e può essere meno suscettibile ai risultati falsi positivi rispetto al test LE.

Abbondanza di contenuto proteico eritrocitario serve come indicatore diagnostico della lesione vascolare

La lesione vascolare nel tratto urinario, tipicamente associata all’infiammazione, viene valutata con test di livello per l’emoglobina e il conteggio microscopico dei globuli rossi nell’analisi delle urine convenzionale. Considerando l’alto arricchimento di proteine distinte negli eritrociti, siamo stati in grado di sviluppare un approccio proteomico equivalente ai test convenzionali per l’ematuria. Sono state determinate abbondanze sommate di 32 proteine dei globuli rossi, comprese le subunità dell’emoglobina, la proteina di trasporto dell’anione di banda 3, la proteina di membrana integrale di banda 7 e l’anidrasi carbonica-1, rispetto al contenuto proteico totale in ciascun campione UP, mostrato dai segmenti di barra verde del grafico visualizzato in Figura 2. Queste quantità di proteine sono elencate come punteggi ERY in (file aggiuntivo 3: Tabella A3) per ciascun campione. Non c’era evidenza di una buona correlazione tra i punteggi NAD o i risultati del test LE con i punteggi ERY, suggerendo che, anche nei casi di rilevamento di un agente patogeno (mostrato dalla colorazione della barra orizzontale nella parte inferiore del grafico in Figura 2), l’infiltrazione dei neutrofili del tratto urinario non sempre comporta ematuria significativa e lesioni tissutali. Impostando le soglie per l’ematuria a 2+ per il test dell’astina di livello e 4.5% per il punteggio ERY, c’era accordo tra l ‘ 81% di tutti i casi. Per i 21 casi in cui i punteggi non erano d’accordo, sono stati valutati i conteggi microscopici dei globuli rossi. Utilizzando un conteggio superiore a 10 cellule per campo ad alta potenza (HPF) come prova di ematuria, abbiamo scoperto che in due terzi dei casi l’analisi microscopica era in accordo con i dati proteomici. Concludiamo che i punteggi proteomic ERY forniscono una buona stima quantitativa dell’ematuria nelle urine.

Campioni di urina arricchiti in proteine implicate nelle attività del complemento e nella coagulazione

Abbiamo osservato che l’analisi HCLPO applicata a tutti i profili proteomici urinari ha raggruppato 21 proteine con ruoli funzionali nelle vie di coagulazione e / o nel sistema del complemento (File aggiuntivo 4: Figura A1). La logica per misurare le abbondanze proteiche relative a queste vie infiammatorie congiuntamente si è basata anche su rapporti di ampie interazioni funzionali . Abbiamo identificato 42 proteine associate alle attività del sistema del complemento e alla coagulazione (CAC) le cui abbondanze sommate sono incluse come punteggio CAC per ogni campione UP in (File aggiuntivo 3: Tabella A3). Il sistema del complemento contribuisce alla risposta di fase acuta e all’immunità innata e i componenti distinti sono pro – o anti-infiammatori. Un componente centrale è il componente complemento C3. C3 matura nell’opsonina C3b e nell’anafilatossina C3a e viene secreto nel plasma sanguigno e nel tratto urinario dopo la produzione nelle cellule tubulari renali . C3 svolge un ruolo nell’infezione del tratto urinario superiore e nell’assorbimento e nella quiescenza di UPEC nelle cellule uroepiteliali eventualmente associati al problema clinico delle UTI ricorrenti . Anche se le quantità di proteine legate alle attività del complemento e alla coagulazione non erano così elevate, l’analisi HCLSO ha generato due cluster di campioni, adiacenti nell’albero e con un numero totale di campioni 12, caratterizzati da un’abbondanza relativamente elevata di tali proteine (i cluster CAC in Figura 1). I cluster CAC hanno rivelato un basso numero di casi con un ID per un agente patogeno (3 su 12). I punteggi CAC sono stati tracciati in Figura 2 raffigurati dai segmenti di barra rossa di ciascun campione (colonna). Elevate quantità complessive di proteine CAC non si correlano bene con elevate quantità di proteine neutrofile, suggerendo che le attività infiammatorie mediate dal sistema del complemento (ad esempio, C3 e C4) e la coagulazione (ad esempio, fibrinogeno) possono essere regolate separatamente in caso di invasione del patogeno o altri stress a cui il tratto urinario è stato esposto nei pazienti. Elevate quantità di proteine CAC e ERY sono state osservate più frequentemente in tandem. Molte proteine della coagulazione e del complemento sono davvero abbondanti nel plasma sanguigno. Questo fluido corporeo perde nel lume del tratto urinario dopo lesioni vascolari. I test di analisi delle urine equivalenti alla misurazione dei punteggi CAC sono raramente utilizzati nei laboratori clinici.

Precipitazione di sali di acido urico e profili proteomici dei sedimenti urinari associati

L’ispezione visiva dei 12 campioni UP nei cluster CAC ha rivelato che nove campioni di urina erano altamente torbidi e dieci granuli di urina relativamente grandi con una colorazione rosa-marrone chiaro. Queste caratteristiche sono state collegate ad alti livelli di saturazione di acido urico e precipitazione di sali di acido urico, specialmente a un pH inferiore a 6, nelle urine. La precipitazione dell’acido urico può essere uno stato precursore della formazione di calcoli urinari . È ragionevole supporre che le apparenze torbide dei campioni abbiano contribuito a identificare erroneamente i precipitati come batteri durante la microscopia. Era disponibile solo una cartella clinica che segnalava l’insorgenza di calcoli renali (GV_64). Sebbene il profilo proteomico per questo paziente non facesse parte del cluster CAC, le caratteristiche visive del campione dichiaravano anche torbidità e un colore del pellet di urina da rosa a marrone chiaro. Assumiamo che le proteine relativamente abbondanti nella frazione solubile dell’urina si leghino ai precipitati salini e quindi contribuiscano a modelli distinti di abbondanza proteica nei rispettivi campioni UP. In effetti, le proteine generalmente solubili nelle urine e normalmente di bassa abbondanza nei pellet urinari sono state aumentate in abbondanza in alcuni campioni di cluster CAC rispetto a un controllo senza evidenza di UTI e precipitati salini (LG_21). Esempi di tali proteine sono IgG γ-chain, AMBP (bikunin) e fibrinogeno γ-chain, come mostrato in Figura 4. Le proteine defensin-1 e le subunità HBA1 e HBD dell’emoglobina sono state maggiormente aumentate in abbondanza rispetto ai dati per LG_21. Sebbene la maggior parte delle proteine mostrate nella Figura 4 sia nota per essere aumentata nelle urine e nel plasma come conseguenza di lesioni locali e contribuisca alla risposta in fase acuta, questi dati hanno mostrato un’elevata variabilità quantitativa. Il significato patologico, in particolare la lesione nel tratto urinario, non può essere dedotto da questi dati. Profili proteomici sono stati recentemente riportati per la matrice di pietra urinaria . Tra le proteine più frequentemente osservate nella matrice di pietra c’erano catene pesanti IgG, subunità di fibrinogeno, S100-A8, lisozima C e LTF, proteine mostrate anche nella trama della Figura 4. Ulteriori indagini sono necessarie per valutare il valore dell’analisi proteomica per identificare i biomarcatori da campioni di urina contenenti precipitati di sali di urina, ad esempio per valutare il rischio di formazione di calcoli renali.

Abbondanza di proteine selezionate in campioni con evidenza di precipitazione salina nelle urine. I campioni che iniziano con nm_ (nessun microbi) non hanno mostrato prove di colonizzazione batterica, ma i sedimenti di urina avevano un aspetto visivo che suggeriva precipitati di sale di acido urico ed erano presenti in due cluster CAC. LG_21 (Lactobacillus) rappresentava l’assenza di infiammazione. Il paziente associato al campione GV_64 (G. vaginalis) è stato diagnosticato con calcoli renali. Oltre a quelle proteine descritte nella legenda della Figura 3, altre sono il componente del complemento C3 (C3), ceruloplasmina (CP), inibitore dell’attivatore del plasminogeno-3 (PAI-3), AMBP (bikunin), emoglobina δ-subunità (HBD) e immunoglobulina γ-catena (Ig gamma). Tutte queste proteine sono implicate nella risposta di fase acuta, che è iniziata tipicamente dalla lesione del tessuto e dall’invasione del patogeno. I profili del campione mostrano un’elevata variabilità delle quantità proteiche, sebbene le proteine distinte in fase acuta siano state aumentate rispetto al controllo LG_21 in alcuni campioni.

Colonizzazione uretrale da parte di batteri commensali che non suscitano risposte immunitarie dell’ospite

Le tecnologie di sequenziamento del DNA altamente parallele hanno rivelato che l’urina non è completamente sterile e la nozione di microbioma urinario si è evoluta come un argomento di ricerca interessante . È probabile che le parti esterne dell’uretra, specialmente nelle donne, siano colonizzate da batteri provenienti da fonti perineali e vaginali. È anche evidente che la raccolta non ottimale di urina pulita da pazienti di sesso femminile può causare la contaminazione delle urine con proteine e batteri commensali dalla cavità vaginale. I dati presentati qui possono essere spiegati da, ma non distinguono i due scenari di cui sopra. Circa il 25% dei profili proteomici urinari ottenuti in questo studio sono stati arricchiti per proteine secrete nelle urine in un ambiente fisiologicamente normale (ad esempio uromodulina e citocheratine) o abbondantemente prodotte da cellule epiteliali liberate dalle superfici mucose che rivestono le vie urinarie e vaginali. L’analisi HCLSO ha identificato quattro cluster (Figura 1), un grande cluster con 15 campioni UP, derivati da pazienti di sesso femminile con solo due eccezioni. I profili hanno rivelato un’elevata abbondanza di proteine citoscheletriche (ad esempio, α-actine e annexine), proteine desmosomiali (ad esempio, desmoplakina e periplakina) e proteine dell’involucro cellulare cornificato (ad esempio, citocheratine, cornulina e piccola proteina ricca di prolina 3). Le proteine appartenenti alle prime due categorie sono presenti nella maggior parte dei tipi di cellule tra cui le cellule uroteliali , mentre l’epitelio squamoso stratificato situato nel meato uretrale e nel tratto vaginale produce proteine da tutte queste categorie abbondantemente . L’esame microscopico dei sedimenti urinari ha confermato l’aumento del contenuto di cellule epiteliali squamose con punteggi ≥ 2+ per la maggior parte dei campioni presenti nei quattro cluster (file aggiuntivo 3: Tabella A3), denominati uromodulina e cluster di cellule epiteliali squamose con batteri vaginali (USEV) da qui in poi. Anche l’uromodulina , una proteina che contribuisce all’equilibrio acqua/elettrolita nel tratto urinario, era abbondante nei campioni del cluster USEV. I batteri vaginali (Lactobacillus e G. vaginalis) sono stati identificati da 22 campioni su 30 e i batteri erano assenti in 5 di questi campioni. I dati proteomici hanno confermato un livello molto basso di infiammazione per i cluster USEV nel 74% dei casi secondo i punteggi NAD come evidente dalle posizioni dei campioni nel grafico della Figura 2. Un profilo rappresentativo del cluster USEV è LG-23, con un punteggio NAD del 20% e basse abbondanze di proteine associate all’infiammazione ad eccezione di defensin-1 e S100A8 (Figura 3). Rispetto ai profili per SA_112 e PM_20, tutte le proteine che contribuiscono all’infiammazione erano meno abbondanti in LG_23. G. vaginalis può essere un agente patogeno opportunistico nelle vie urinarie e vaginali. Il clustering dei profili proteici ospiti nei cluster USEV, selezionati per gli ID di Lactobacillus, G. vaginalis o entrambe le specie, ha indicato la mancanza di una forte risposta immunitaria nei confronti di queste specie batteriche. Concludiamo che l’analisi proteomica ha valore diagnostico fornendo la prova dell’assenza di un’infezione nel tratto urogenitale delle donne.

Colonizzazione uretrale da agenti patogeni opportunistici

I cluster USEV includevano tre casi in cui sono stati identificati agenti patogeni comuni del tratto urinario, UPEC e K. pneumoniae. I due casi (EC_13 e KP_55) hanno mostrato bassi punteggi NAD e ERY, che erano in accordo con l’assenza di infiammazione innescata dai neutrofili e lesioni vascolari. Le abbondanze relative delle proteine visualizzate in Figura 3 per questi due casi e la loro somiglianza con il modello osservato per LG_23 hanno supportato la nozione che le risposte immunitarie caratteristiche per UTI non sono state suscitate dopo la colonizzazione da parte dei batteri. Non è possibile valutare se i casi rappresentino batteriuria asintomatica (ASB) a causa di una scarsa conoscenza delle risposte immunitarie a livello molecolare per ASB. In sintesi, questi dati supportano l’idea che i profili proteomici possano identificare casi di colonizzazione uretrale da parte di uropatogeni senza attivazione del sistema immunitario innato.

Contaminazione vaginale con evidenza di infezioni urogenitali

L’analisi HCLSO ha generato un cluster di campioni UP che abbiamo chiamato cluster di contaminazione vaginale (VCO), mostrato in Figura 1. I profili di cluster VCO presentavano elevate abbondanze di proteine dell’involucro cellulare citoscheletrico, desmosomiale e cornificato, ma basse o moderate quantità di uromodulina, suggerendo che il contenuto proteico vaginale era aumentato in questi campioni. È stato calcolato il punteggio VCO, un rapporto quantitativo di cinque proteine espresse nel tessuto epiteliale cervicovaginale con specificità relativamente elevata secondo il database TiGER rispetto all’uromodulina. Queste proteine erano cornifelina, cornulina, serpina B3, galectina-7 e il proteoglicano mucina-5B. Molecole proinfiammatorie specifiche dei neutrofili come la proteina S100-A12 e il lisozima (LYZ) e proteine indicative o rispondenti alla lesione vascolare (HBA1 e fibrinogeno-β, rispettivamente) erano più abbondanti nel cluster VCO rispetto al cluster USEv, come mostrato per KP_10 rispetto a LG_23 nella Figura 3. Il cluster VCO conteneva 14 campioni, tutti tranne uno derivato da pazienti di sesso femminile, metà dei quali erano associati a un ID per un uropatogeno. In cinque campioni è stato identificato G. vaginalis o Lactobacillus. L’evidenza clinica ha suggerito sanguinamento vaginale per il paziente relativo al campione KP_10, a supporto della diagnosi di un’infezione urogenitale o vaginale con K. pneumoniae. I punteggi VCO sono inclusi nel file aggiuntivo 3: Tabella A3. Un test Wilcoxon rank sum confrontando i punteggi VCO dei cluster VCO e USEV ha prodotto un valore p di 0,017, suggerendo che il punteggio è utile per discernere no o minore dalla contaminazione vaginale maggiore nei campioni di urina. Nessuna valutazione chiara può essere fatta per quanto riguarda l’utilità del punteggio VCO per distinguere un UTI da infezione vaginale.

L’analisi proteomica dei sedimenti urinari identifica microbi con livelli di sensibilità e specificità paragonabili a quelli della coltura urinaria

Abbiamo identificato batteri da 76 campioni in SU e Candida albicans da un campione in SU (63% di tutti i casi analizzati). Le colture di urina sono state eseguite in soli 55 casi, di cui il 44% ha identificato almeno un agente patogeno, il 24% organismi commensali e il 17% non ha mostrato alcuna crescita microbica (file aggiuntivo 3: Tabella A3). Nel contesto delle identificazioni dei patogeni, i dati proteomici e i risultati UC non erano sempre in accordo (Tabella 1). Diversi motivi sembrano contribuire ai disaccordi. Seguono le sfide dell’interpretazione dei dati metaproteomici basati sulle proteine microbiche identificate. In primo luogo, gli ID proteici per uropatogeni meno comuni possono essere persi a causa dell’assenza delle loro sequenze proteiche dal database cercato. Le specie batteriche rappresentate nel database sono state identificate tramite analisi proteomiche (K. pneumoniae ed E. faecalis) in due casi, ma i dati UC hanno suggerito la presenza delle specie filogeneticamente vicine Enterobacter aerogenes ed E. faecium, rispettivamente. In secondo luogo, gli organismi microbici presenti in bassa abbondanza nelle urine sono più difficili da identificare in presenza di microbi altamente abbondanti, specialmente se le specie microbiche condividono un’ampia identità di sequenza tra proteine ortologhe. I profili EC_85 e KP_11 in (File aggiuntivo 5: Dataset A1) illustrano questo problema, e in particolare riguarda la famiglia delle Enterobacteriaceae che causano la maggior parte di tutte le UTI. Annotazioni genomiche imprecise, ad esempio geni mancanti, per una specie (presente nel campione UP) portano all’identificazione di proteine ortologhe correttamente annotate nel genoma di una specie correlata (ma assenti nel campione UP). I piccoli peptidi triptici sono identificati in un’analisi proteomica del fucile da caccia, che rende le assegnazioni errate della proteina dall’algoritmo di ricerca più probabili nei casi dell’identità altamente di sequenza. In terzo luogo, l’ID dei batteri presenti in bassi conteggi nelle urine, meno di ~ 10.000 cellule/mL, combinato con un elevato background proteomico dell’ospite può essere mancato perché le proteine ospite e microbiche non sono rilevate separatamente da LC-MS/MS. Bassi conteggi di CFU per gli organismi batterici secondo i dati UC hanno mostrato un tasso di corrispondenza più basso con ID proteomici rispetto ad alti conteggi di CFU (File aggiuntivo 3: Tabella A3). Al contrario, le identificazioni proteomiche dei microbi hanno i vantaggi di essere indipendenti dalla cultura e di fornire informazioni sulla virulenza, sulla resistenza agli antibiotici, sullo stress riscontrato e sullo stato di crescita per i patogeni identificati. Due esempi che rivelano tali dati completi sono forniti in (file aggiuntivo 5: Dataset A1). In un set di dati (EC_85), sono state profilate le proteine di UPEC, G. vaginalis e Lactobacillus. Nell’altro set di dati (KP_11), la causa dell’UTI era K. pneumoniae. La tabella 1 fornisce una panoramica del confronto del test del nitrito, identificando le enterobatteriacee nelle urine in base alla loro capacità di ridurre i nitrati e ai risultati UC con i dati proteomici. il 90% dei test nitriti positivi riguardava infatti casi di batteriuria con UPEC o K. pneumoniae come agente causale e sono stati invariabilmente identificati anche con i metodi proteomici e UC. A differenza dell’analisi proteomica, i test dei nitriti sembravano non essere abbastanza sensibili da identificare le enterobatteriacee in dieci casi. I test sui nitriti non sono risultati positivi in 21 casi in cui l’ID delle analisi proteomiche era G. vaginalis. Per quanto riguarda le differenze nell’ID patogeno tramite metodi proteomici rispetto a UC, gli streptococchi β-emolitici sono stati identificati da esperimenti UC in tre casi, mentre i dati proteomici hanno suggerito la presenza di G. vaginalis. Come mostrato nella Tabella 1, il numero di ID corrispondenti per UPEC e, in misura minore, per K. pneumoniae, era elevato. In sintesi, il metodo proteomico ha dimostrato una maggiore sensibilità rispetto al test del nitrito e livelli di sensibilità e specificità paragonabili a UC. L’alto sfondo proteomico dell’ospite in un campione di urina diminuisce la sensibilità per l’identificazione microbica.