L'espressione costitutiva di geni selezionati dal pentoso fosfato e aromatico percorsi aumenta il shikimic acid resa in alta glucosio batch culture di un ceppo di Escherichia coli privi di PTS e pykF | Cellula Microbica Fabbriche

Costruzione di ceppi derivati da PB12 aroK-aroL- contenente un plasmide progettato per l’espressione costitutiva di un sintetico operone usato nella produzione di acido shikimico
Valutazione degli effetti causati dall’inattivazione di pykF in ceppi che esprimono l’operone Aro6
Profili di fermentazione di AR36 in colture batch
Approfondimenti su glicolitico e acetato di metabolismi di ceppo AR36 mediante RT-qPCR

Costruzione di ceppi derivati da PB12 aroK-aroL- contenente un plasmide progettato per l’espressione costitutiva di un sintetico operone usato nella produzione di acido shikimico

Prove inedite dal nostro laboratorio indicano che la produzione di composti aromatici nel ceppo evoluto in laboratorio PB12 può raggiungere livelli più alti quando l’induzione trascrizionale dei geni coinvolti nella canalizzazione del flusso di carbonio nella via AAA avviene all’inizio delle fermentazioni. Tenendo conto di questa osservazione, è stata sviluppata una nuova strategia per ottimizzare la produzione di SA in PB12 che trasportano geni aroK e aroL inattivi (Figura 1). Questa strategia includeva la progettazione e la costruzione di un plasmide per l’espressione forte e stabile di sei geni chiave disposti sotto forma di un operone sintetico, controllato esclusivamente da un singolo promotore Trc. Al fine di ridurre il carico metabolico, un singolo plasmide derivato da pBR327 che trasportava il locus par per una maggiore stabilità plasmidica è stato utilizzato come vettore , dopo aver incorporato un frammento contenente il promotore, il polilinker e i terminatori trascrizionali da pTrc99A (Figura 2).

La parte iniziale dell’operone è stata costruita mediante amplificazione sequenziale e legatura delle prime 4 sequenze codificanti (aroB, tktA, aroGfbr e aroE) nel polilinker del plasmide pBRINT-Ts Cm, usato come scaffold di clonazione (vedi Metodi). Successivamente, la costruzione a 4 geni è stata trasferita al plasmide ibrido pTrc327par in combinazione con altri 2 geni (aroD e zwf), portando ad un operone da 8 Kb contenuto in un plasmide da 12 Kb (Figura 2). Il plasmide risultante, chiamato pTrcAro6, è stato trasformato nel ceppo PB12 aroK-aroL privo del gene lacIq, consentendo l’espressione costitutiva dei geni di interesse (Tabella 1). Per semplicità, il ceppo PB12 aroK-aroL-lacI generato è stato definito AR2. Dopo che il gene pykF è stato inattivato in AR2, il ceppo risultante è stato chiamato AR3. I ceppi derivati da AR2 e AR3 che trasportano il plasmide pTrcAro6 sono stati denominati AR26 e AR36, rispettivamente (Tabella 1).

Tabella 1 Ceppi di Escherichia coli e plasmidi utilizzati in questo rapporto

La disposizione spaziale delle sequenze codificanti che costituiscono l’operone sintetico in pTrcAro6, affiancata dal promotore Trc e dai terminatori trascrizionali, è mostrata in Figura 2. aroB è il primo gene nell’operone poiché diverse evidenze indicano che la sua bassa espressione è uno dei passaggi limitanti nella produzione di composti aromatici . Il plasmide pTrcAro6 porta anche i geni tktA e aroGfbr, i cui prodotti sono coinvolti nella sintesi E4P e nella sua condensazione con PEP per formare DAHP, il primo composto aromatico (Figura 1). Sono stati inclusi anche i geni aroD e aroE per promuovere una conversione efficiente del DHQ in SA. Inoltre, questo plasmide porta il gene zwf, codificante per il primo enzima del PPP (Figura 1). La decisione di includere questo gene si basava sulle seguenti osservazioni: 1) la sovraespressione di zwf ha sostanzialmente recuperato la perdita del tasso di crescita dovuta al carico metabolico plasmidico nel ceppo JM101 che cresce sul glucosio come unica fonte di carbonio ; 2) è stato riportato che il ceppo PB12 mostra una partizione del flusso di carbonio particolarmente bassa al nodo glucosio 6-fosfato (G6P) verso il PPP (5% del G6P consumato rispetto al 22% nel ceppo parentale JM101). Pertanto, una sovraespressione di questo gene dovrebbe aumentare la disponibilità di NADPH, richiesta in quantità catalitiche dall’enzima shikimato deidrogenasi (AroE), e può alleviare le potenziali influenze di crescita reindirizzando più G6P verso la biosintesi dei nucleotidi e degli amminoacidi nei ceppi derivati da PB12 . Tuttavia, gli esperimenti presentati in questo rapporto non miravano a sezionare l’effetto specifico di qualsiasi gene utilizzato, ma cercavano invece di caratterizzare le conseguenze dell’espressione di tutti loro come un operone.

Al fine di promuovere una traduzione efficiente di ogni gene, ogni sequenza codificante è stata amplificata utilizzando primer designati che hanno introdotto una sequenza di consenso Shine-Dalgarno situata a 8 bp a monte del sito di partenza della traduzione. La sequenza nucleotidica dell’operone costruito è presentata nel file aggiuntivo 1.

Valutazione degli effetti causati dall’inattivazione di pykF in ceppi che esprimono l’operone Aro6

Per valutare gli effetti causati dall’inattivazione di pykF sulla produzione di SA, le prestazioni dei ceppi di produzione AR26 (pykF+) e AR36 (pykF-) sono state confrontate utilizzando flaconi shake contenenti 15 g/L di Glc e 5 g/L di YE. Come controllo, sono stati inclusi anche gli stessi ceppi contenenti un plasmide pTrc327par vuoto (senza l’operone Aro6), AR2e e AR3e.

Anche se la SA si è accumulata in tutti i casi, come previsto per i mutanti in aroK e aroL, i ceppi contenenti pTrcAro6 hanno raggiunto concentrazioni di SA più elevate rispetto a quelli con un plasmide vuoto (Figura 3b). Inoltre, il titolo SA era quasi due volte più alto in AR36 che in AR26 (6,1 g/L contro 3,3 g/L). Una diminuzione del consumo di Glc è stata osservata nel ceppo AR26 dopo circa 18 ore di coltura, in correlazione con un’alta concentrazione di acetato e un arresto nella produzione di SA. Al contrario, il ceppo AR36 ha mostrato un consumo di Glc costante e sono state prodotte quantità trascurabili di acetato (Figura 3c, 3d). Questi risultati dimostrano che i geni presenti nell’operone artificiale sono funzionali e promuovono la produzione di SA sin dall’inizio della cultura. La loro espressione costitutiva ha diminuito il tasso di crescita specifico (μ) del 25% nello sfondo pykF+ e lo ha aumentato marginalmente nella variante pykF, ma non ha causato cambiamenti significativi alla biomassa massima prodotta (Xmax) rispetto ai ceppi con un plasmide vuoto (Figura 3a). Sorprendentemente, nei ceppi che esprimono l’operone in queste condizioni di crescita, l’inattivazione del gene pykF ha aumentato la produzione di SA, eliminato l’accumulo di acetato e consentito un consumo costante di Glc.

Per determinare se la maggiore produzione di acetato e la minore produzione di SA in AR26 rispetto a AR36 sono una conseguenza della intrinsecamente bassa disponibilità di ossigeno e acidificazione del mezzo nelle colture di shake flask, entrambi i ceppi sono stati coltivati in fermentatori batch da 1 L in condizioni controllate di pH e tensione dell’ossigeno disciolto (DOT). Come approccio per aumentare il titolo SA, la concentrazione iniziale di Glc in questi esperimenti è stata portata a 100 g/L e la concentrazione YE è stata contemporaneamente aumentata a 15 g/L per consentire una maggiore generazione di biomassa.

In queste condizioni il ceppo AR36 produceva 42 g/L di SA in 60 h, consumando tutto il Glc e accumulando 12 g/L di acetato. Al contrario, dopo 47 h il ceppo AR26 ha prodotto un massimo di 13 g/L di SA, non ha esaurito il Glc e ha accumulato 29 g/L di acetato (Figura 3e e Tabella 2). Indipendentemente dalle condizioni controllate nei fermentatori, dove il pH era mantenuto a 7 e il PUNTO era sempre superiore al 20%, i profili di produzione di entrambi i ceppi assomigliavano al comportamento osservato nei flaconi shake, con AR26 che produceva più acetato e meno SA. Anche quando il tasso di consumo volumetrico globale di Glc (Qsglobal), μ e Xmax raggiunti da entrambi i ceppi erano simili, la produttività, la resa e il titolo erano più di due volte più alti in AR36 che in AR26 (Figura 3e e Tabella 2).

Tabella 2 dati Comparativi da 1 L fermentazioni batch di ceppi AR26 e AR36, utilizzando 100 g/L di Glc e 15 g/L di VOI come substrati

è notevole che le grandi differenze in acetato e SA di produzione sono stati osservati interrompendo un solo gene, che illustra i vantaggi della combinazione di inattivazione di PTS e pykF quando si utilizza un’espressione costitutiva sistema evoluto ceppo di E. coli. Per tenere conto dei miglioramenti osservati nella produzione di SA, suggeriamo che l’espressione precoce e costante degli enzimi codificati nell’operone potrebbe mantenere un consumo costante di intermedi glicolitici in tutte le colture, prevenendo elevate fluttuazioni nelle loro concentrazioni intracellulari. Ipotizziamo che la combinazione di questo stato metabolico stazionario con un flusso ridotto da PEP a piruvato causato dall’inattivazione del gene pykF possa aumentare la disponibilità di PEP e altri precursori glicolitici per la produzione di SA senza diminuire il tasso di consumo di Glc. Tuttavia, riconosciamo che in assenza di concentrazioni misurate di metaboliti intracellulari, queste osservazioni sono speculative.

Profili di fermentazione di AR36 in colture batch

Tenendo conto dei risultati precedenti, AR36 è stato selezionato per un’ulteriore caratterizzazione delle sue prestazioni cinetiche e stechiometriche in fermentatori da 1 L. Per raggiungere tale scopo, la produzione di SA è stata testata con tre diverse condizioni di coltura ad alto substrato. Crescita, Glc e sottoprodotti sono stati misurati per ciascun caso, che a sua volta ha permesso un confronto tra le produttività e le rese.

In primo luogo, sono stati utilizzati 50 g/L di Glc e 15 g/L di YE (Figura 4a). La crescita si è verificata durante le prime 10 ore, generando 6,3 g / L di peso delle cellule secche con un μ di 0,53 h-1. In questa condizione, sono stati prodotti 24 g/L di SA in 32 h. Il consumo di Glc e la produzione di SA si sono verificati dall’inizio della fermentazione e sono durati fino all’esaurimento del Glc, sebbene il tasso di consumo specifico Glc (qs) e la produttività specifica SA (qp) fossero più alti in fase esponenziale (Tabella 3). La resa risultante di SA su Glc (YSA/Glc) era 0,47 mol/mol e la produttività volumetrica globale di SA (Qpglobal) era 0.74 gSA/L*h (Tabella 3). Per quanto riguarda l’accumulo di sottoprodotti nella via SA, concentrazioni di 2,4 g/L di DAHP, 2,1 g/L di DHS, 1,4 g/L di QA, 0,4 g/L di GA e 0,3 g/L di DHQ, erano presenti nel surnatante alla fine della fermentazione (Figura 5a). In queste condizioni, praticamente nessun acetato è stato prodotto durante il corso della fermentazione, raggiungendo una concentrazione massima di 1,5 g/L dopo 32 h (Figura 4a).

Tabella 3 Confronto di misurata metaboliti e calcolato cinetici e stechiometrici parametri tra tre fermentazioni di ceppo AR36 con diverse concentrazioni di substrato

Considerando che 50 g/L di Glc sono stati consumati completamente, è stato avviato un secondo esperimento batch con 100 g/L di Glc e 15 g/L di YE. Come indicato nel confronto con AR26 nella sezione precedente, AR36 coltivato in queste condizioni ha prodotto circa 42 g / L di SA in 60 h (Figura 4b). In questo caso, dopo aver consumato circa 100 g/L di glucosio e aver raggiunto la massima concentrazione di SA, il ceppo ha prodotto 12 g/L di acetato. I valori ottenuti per YSA / Glc, Qpglobal, Qsglobal, Xmax e μ erano simili a quelli ottenuti con 50 g/L di Glc e 15 g/L di YE (Tabella 3). Questi esperimenti mostrano che quando si utilizza la stessa concentrazione di YE, il doppio della quantità di Glc viene consumata in quasi il doppio del tempo, indicando che il tasso medio di consumo di glucosio viene mantenuto tra entrambe le condizioni di coltura. Concentrazioni di 4,8 g/L di DAHP, 2,8 g/L di DHS, 3,4 g/L di QA, 0.7 g/L di GA e 0,9 g / L di DHQ erano presenti nel surnatante dopo 60 ore (Figura 5b). È interessante notare che, raddoppiando la concentrazione di Glc, i prodotti intermedi della via AAA sono aumentati in modo abbastanza proporzionale con la SA, indicando che il consumo di 100 g/L di Glc non ha apparentemente generato nuove strozzature del flusso di carbonio. Di conseguenza, la quantità di SA formata rispetto ai composti aromatici totali prodotti era vicina all ‘ 80% in entrambi gli esperimenti (Figura 6).

L’effetto dell’aumento dell’YE sulla produttività delle SA è stato studiato con una terza serie di esperimenti, utilizzando 100 g/L di Glc e 30 g/L di YE. Sebbene la biomassa fosse raddoppiata quando si utilizzava il doppio della concentrazione di YE, il titolo SA, μ e YSA/Glc erano molto simili a quelli ottenuti nella coltura con 100 g/L di Glc e 15 g/L di YE (Figura 4b e Figura 4c). In combinazione con i dati ottenuti dalle altre due condizioni, questi risultati suggeriscono che la quantità di YE determina principalmente la biomassa massima che può essere raggiunta. Inoltre, un incremento della concentrazione iniziale di YE non ha alterato il titolo SA, e supporta l’osservazione che SA viene prodotto principalmente dal glucosio. La relazione diretta tra la concentrazione iniziale di YE e la biomassa massima generata, indipendentemente dalla concentrazione iniziale di Glc testata in queste condizioni di crescita, suggerisce che uno o più nutrienti limitanti vengono forniti dall’YE. Sembrerebbe anche che tali nutrienti non possano essere sintetizzati da Glc, quindi il loro esaurimento da YE limita la crescita molto prima che Glc sia esaurito. Si prevede che gli aminoacidi aromatici e le vitamine presenti nel YE che sono necessari per contrastare l’auxotrofia AR36 diventeranno limitanti; tuttavia, altri composti in questo mezzo complesso possono anche svolgere un ruolo nella limitazione della crescita nel tempo.

Per una concentrazione iniziale di YE di 30 g/L, sono stati consumati e prodotti, rispettivamente, un totale di 106 g/L di Glc e 43 g/L di SA in circa la metà del tempo rispetto alla fermentazione con 15 g/L di YE. Con 30 g/L di YE, il Qsglobal e il Qpglobal sono raddoppiati, rispetto alle fermentazioni con 15 g/L di YE, anche se il titolo SA è rimasto invariato (Tabella 3). Poiché anche la biomassa aumentava di due volte, il qp calcolato e il qs erano simili tra i tre esperimenti, sia in fase esponenziale che stazionaria, mostrando la robustezza metabolica del ceppo ingegnerizzato nelle condizioni testate.

Inoltre, i risultati hanno mostrato che un aumento della concentrazione di YE non ha aumentato considerevolmente la concentrazione degli intermedi della via SA (Figura 5c). A questo proposito, è stato riconosciuto che la presenza di elevate quantità di intermedi della via può influire negativamente sul recupero di SA dal brodo di fermentazione . Questa preoccupazione ha diretto alcuni sforzi nell’argomento, portando alla sperimentazione di condizioni di coltura, background genetici e l’uso di analoghi di glucosio non metabolizzabili, come tentativi di minimizzare la generazione di sottoprodotti .

In questi esperimenti è stata rilevata un’alta percentuale di SA rispetto ai sottoprodotti senza applicare ulteriori modifiche al ceppo o al processo. La concentrazione di ciascun intermedio della via è stata confrontata con la somma di tutti gli intermedi aromatici e le loro percentuali sono state utilizzate per calcolare il rapporto molare di SA per ciascun sottoprodotto alla fine delle fermentazioni (Figura 6). Il rapporto di SA si è rivelato superiore a 10 per DHS, QA o DAHP e superiore a 40 per GA o DHQ per tutte le concentrazioni di substrato testate. Sorprendentemente, in tutte le condizioni le rese SA ottenute erano vicine al 50% del massimo teorico e le rese dei composti aromatici totali (TAC) erano superiori al 60% del massimo teorico, stimato come 0.86 molTAC / molLlc (vedere Metodi e Figura 6). Ciò riflette l’efficiente reindirizzamento del glucosio verso la via AAA nel ceppo AR36, anche quando si utilizzano colture batch ad alto contenuto di glucosio. Il rapporto tra SA e sottoprodotti, così come le rese SA e TAC ottenute sono abbastanza costanti per tutte le condizioni valutate e rappresentano a nostra conoscenza i valori più alti riportati per un processo di fermentazione di produzione SA. Questi miglioramenti possono essere giustificati tenendo conto del fatto che la piattaforma presente nel ceppo ingegnerizzato consente un’espressione più omogenea degli enzimi necessari su un background genetico efficiente. Questo, in contrasto con altri sistemi di espressione in cui i geni richiesti sono espressi da plasmidi separati, sotto diversi promotori, o in ceppi non ottimizzati per un uso efficiente di alti livelli di Glc. Oltre ai vantaggi relativi alla dinamica dell’espressione genica, il fatto che IPTG non sia necessario per indurre l’operone Aro6 rappresenta un importante vantaggio economico per il processo di produzione, poiché l’alto prezzo dell’IPTG ne limita l’uso nelle fermentazioni su larga scala.

Approfondimenti su glicolitico e acetato di metabolismi di ceppo AR36 mediante RT-qPCR

Per ottenere una più profonda comprensione dei cambiamenti metabolici indotti dall’espressione costitutiva del Aro6 sintetico operone nel ceppo AR36, i livelli di trascrizione di diversi geni sono stati misurati in tre diverse fasi di crescita, in culture con 50 g/L di Glc e 15 g/L di VOI. Come dettagliato nei metodi, i dati ottenuti dalla fase esponenziale iniziale (EE), dalla fase esponenziale tardiva (LE) e dalla fase stazionaria (ST) sono stati normalizzati rispetto ai valori misurati dal ceppo AR3e a EE, coltivato nelle stesse condizioni di coltura.

I risultati indicano che la presenza e l’espressione dell’operone nel ceppo AR36 aumenta i livelli trascrizionali di diversi geni che codificano per gli enzimi glicolitici durante le fasi EE e LE (Figura 1 e Figura 7a). L’aumento dell’espressione dei geni galP e glk è particolarmente interessante perché è stato riportato che i loro prodotti controllano l’importazione e la fosforilazione del glucosio nel PB12, il ceppo parentale di AR36 . Inoltre, vi è un aumento significativo dei livelli trascrizionali di igp eo, ma non pykA. Questi cambiamenti possono tradursi in una maggiore disponibilità di PEP e fruttosio 6-P (che può essere convertito direttamente in E4P da transketolasi codificata con plasmidi), aumentando la resa di composti aromatici. Teorizziamo che la sovraregolazione osservata dei geni glicolitici nel ceppo AR36 potrebbe essere una delle conseguenze a bassi livelli di alcuni intermedi glicolitici (glucosio 6-fosfato, fruttosio 6-fosfato e PEP), causata dall’espressione forte e costitutiva degli enzimi codificati da operoni che consumano questi metaboliti.

D’altra parte, i livelli trascrizionali dei geni che codificano per enzimi coinvolti nella biosintesi dell’acetato (poxB, ackA e pta) non sono stati modificati dalla presenza dell’operone sintetico, mentre actP e acs, codificanti per enzimi coinvolti nell’assimilazione dell’acetato, sono stati fortemente sovraregolati nelle fasi EE e LE (Figura 7b). La sovraregolazione dei geni actP e acs è stata rilevata anche nella fase di crescita esponenziale nel ceppo parentale PB12 che è in grado di co-utilizzare Glc e acetato in un mezzo minimo . Questi risultati sono correlati con i bassi livelli di acetato nello stato di crescita analizzato (Figura 4a). È importante sottolineare che i valori trascrizionali di questi geni coinvolti nell’assimilazione dell’acetato erano bassi nella fase ST (Figura 7b). Se questa risposta è rappresentativa delle altre condizioni di crescita utilizzate, potrebbe parzialmente spiegare l’accumulo di acetato osservato nelle fermentazioni con 100 g/L di Glc, che consumano quantità maggiori di Glc durante la fase stazionaria (Figura 4b e Figura 4c). Questi risultati evidenziano actP e acs come potenziali bersagli genici per aumentare artificialmente la loro espressione nelle fasi tardive della coltura, sfruttando le capacità attese del ceppo AR36 per utilizzare contemporaneamente Glc e acetato, presenti nel suo ceppo parentale PB12 .

I geni presenti nell’operone sintetico hanno mostrato livelli di espressione molto forti (anche in fase stazionaria), riflettendo la natura costitutiva del promotore e l’elevato numero di copie del plasmide (Figura 7c). Questi risultati sono correlati con il consumo ininterrotto di Glc e la produzione di SA osservati durante l’intera fermentazione (Figura 4a), suggerendo che gli enzimi codificati dai geni nell’operone sono presenti durante tutto il tempo di coltivazione. Si può vedere nella Figura 7c che i livelli di trascrizione di aroD e zwf sono relativamente più alti e più bassi, rispettivamente, rispetto agli altri quattro geni nell’operone. Questa osservazione deve essere presa con cautela perché i sei geni dell’operone vengono confrontati con quelli presenti nel cromosoma del ceppo di riferimento AR3e. Poiché i valori ottenuti per i sei geni non sono normalizzati tra loro, le variazioni tra la loro espressione cromosomica nel ceppo AR3e possono alterare i confronti relativi con il ceppo AR36. Tuttavia, i dati trascrittomici sono coerenti con l’elevato rapporto tra SA e intermedi aromatici ottenuti nelle condizioni testate, che è prevedibile se tutti i geni dell’operone fossero adeguatamente espressi. Insieme ai dati cinetici e stechiometrici, questi risultati evidenziano i benefici dell’impiego di un operone sintetico costitutivamente espresso come strategia alternativa per aumentare la resa di SA da Glc in un ceppo evoluto privo di PTS e pykF.

l’espressione Costitutiva di geni selezionati dal pentoso fosfato e aromatico percorsi aumenta il shikimic acid resa in alta glucosio batch culture di un ceppo di Escherichia coli privi di PTS e pykF

Costruzione di ceppi derivati da PB12 aroK-aroL- contenente un plasmide progettato per l’espressione costitutiva di un sintetico operone usato nella produzione di acido shikimico

Valutazione degli effetti causati dall’inattivazione di pykF in ceppi che esprimono l’operone Aro6

Profili di fermentazione di AR36 in colture batch

Approfondimenti su glicolitico e acetato di metabolismi di ceppo AR36 mediante RT-qPCR

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