Ottenere CHIAREZZA: Processo di idrogel crea cervello trasparente
Processo di chiarezza: intervista con Stanford bioingegnere e psichiatra Karl Deisseroth. Lunghezza: 3:58
“Studiare sistemi intatti con questo tipo di risoluzione molecolare e portata globale – per essere in grado di vedere il dettaglio fine e il quadro generale allo stesso tempo — è stato un importante obiettivo insoddisfatto in biologia, e un obiettivo che la CHIAREZZA inizia ad affrontare”, ha detto Deisseroth.
“Questa impresa di ingegneria chimica promette di trasformare il modo in cui studiamo l’anatomia del cervello e come la malattia la cambia”, ha detto Thomas Insel, MD, direttore del National Institute of Mental Health. “Lo studio approfondito del nostro organo tridimensionale più importante non sarà più vincolato da metodi bidimensionali.”
Cervello di topo adulto intatto prima e dopo il processo di chiarezza di due giorni. Nell’immagine a destra, le strutture cerebrali sottili possono essere viste debolmente come le aree di sfocatura sopra le parole “numero”, “inesplorato”, “continente” e “si estende.”
La ricerca in questo studio è stata eseguita principalmente su un cervello di topo, ma i ricercatori hanno usato CHIAREZZA su zebrafish e su campioni di cervello umano conservati con risultati simili, stabilendo un percorso per studi futuri su campioni umani e altri organismi.
“La CHIAREZZA promette di rivoluzionare la nostra comprensione di come i cambiamenti locali e globali nella struttura e nell’attività del cervello si traducono in comportamenti”, ha detto Paul Frankland, PhD, uno scienziato senior in neuroscienze e salute mentale presso l’Hospital for Sick Children Research Institute di Toronto, che non è stato coinvolto nella ricerca. La collega di Frankland, la scienziata senior Sheena Josselyn, PhD, ha aggiunto che il processo potrebbe trasformare il cervello da “una misteriosa scatola nera” in qualcosa di essenzialmente trasparente.
Un luogo imperscrutabile
Il tumulo di materia grigia contorta e cablaggio che è il cervello è un luogo complesso e imperscrutabile. I neuroscienziati hanno lottato per comprendere appieno il suo circuito nella loro ricerca per comprendere come funziona il cervello, e perché, a volte, non.
Karl Deisseroth
la CHIAREZZA è il risultato di uno sforzo di ricerca in Deisseroth laboratorio per estrarre l’opaco elementi — in particolare i lipidi — da un cervello e ancora mantenere le caratteristiche più importanti completamente intatto. I lipidi sono molecole grasse presenti in tutto il cervello e il corpo. Nel cervello, in particolare, aiutano a formare le membrane cellulari e danno al cervello gran parte della sua struttura. I lipidi rappresentano una doppia sfida per lo studio biologico, tuttavia, perché rendono il cervello in gran parte impermeabile sia alle sostanze chimiche che alla luce.
I neuroscienziati avrebbero voluto estrarre i lipidi per rivelare la struttura fine del cervello senza affettare o sezionare, ma per un problema importante: rimuovere queste molecole strutturalmente importanti fa cadere il tessuto rimanente a pezzi.
Le indagini precedenti si sono concentrate invece sull’automazione dell’approccio di sezionamento/sezionamento, o sul trattamento del cervello con molecole organiche che facilitano solo la penetrazione della luce, ma non con sonde macromolecolari. Con CHIAREZZA, il team di Deisseroth ha adottato un approccio fondamentalmente diverso.
“Abbiamo attinto all’ingegneria chimica per trasformare il tessuto biologico in un nuovo stato che è intatto ma otticamente trasparente e permeabile alle macromolecole”, ha detto Chung, il primo autore del documento.
Questa nuova forma viene creata sostituendo i lipidi del cervello con un idrogel. L’idrogel è costruito all’interno del cervello stesso in un processo concettualmente simile alla pietrificazione, utilizzando quella che è inizialmente una sospensione acquosa di brevi molecole individuali note come monomeri di idrogel. Il cervello intatto e postmortem è immerso nella soluzione dell’idrogel ed i monomeri infondono il tessuto. Poi, quando “termicamente innescato,” o riscaldato leggermente a circa la temperatura corporea, i monomeri iniziano a congelare in lunghe catene molecolari noti come polimeri, formando una maglia in tutto il cervello. Questa maglia tiene tutto insieme, ma, soprattutto, non si lega ai lipidi.
Con il tessuto puntellato in questo modo, il team è in grado di estrarre vigorosamente e rapidamente i lipidi attraverso un processo chiamato elettroforesi. Ciò che rimane è un 3-D, cervello trasparente con tutte le sue strutture importanti-neuroni, assoni, dendriti, sinapsi, proteine, acidi nucleici e così via – intatto e in atto.
Andare le cose meglio
CHIAREZZA poi va meglio. Nel preservare la piena continuità delle strutture neuronali, la CHIAREZZA non solo consente di tracciare le singole connessioni neurali su lunghe distanze attraverso il cervello, ma fornisce anche un modo per raccogliere informazioni ricche e molecolari che descrivono la funzione di una cellula che non è possibile con altri metodi.
“Abbiamo pensato che se potessimo rimuovere i lipidi in modo non distruttivo, potremmo essere in grado di ottenere sia la luce che le macromolecole per penetrare in profondità nel tessuto, consentendo non solo l’imaging 3-D, ma anche l’analisi molecolare 3-D del cervello intatto”, ha detto Deisseroth, che detiene la cattedra di DH Chen.
Usando anticorpi fluorescenti che sono noti per cercare e attaccarsi solo a proteine specifiche, il team di Deisseroth ha dimostrato che può colpire strutture specifiche all’interno del cervello del topo CLARITY-modificato — o “chiarito” — e rendere quelle strutture e solo quelle strutture si illuminano sotto illuminazione. I ricercatori possono tracciare circuiti neurali attraverso l’intero cervello o esplorare profondamente le sfumature del cablaggio del circuito locale. Possono vedere le relazioni tra le cellule e studiare le strutture subcellulari. Possono anche guardare le relazioni chimiche di complessi proteici, acidi nucleici e neurotrasmettitori.
Un rendering tridimensionale del cervello chiarito ripreso dal basso (metà ventrale). Un video fly-through del cervello roditore è disponibile qui.
“Essere in grado di determinare la struttura molecolare delle varie cellule e i loro contatti attraverso la colorazione con anticorpi è una capacità fondamentale di CHIAREZZA, separato dall’ottica di trasparenza, che ci permette di visualizzare le relazioni tra i componenti del cervello in modo completamente nuovi modi,” ha detto Deisseroth, che è uno dei 15 esperti il “dream team” che tracciare gli obiettivi per i 100 milioni di dollari per la ricerca sul cervello iniziativa annunciata il 2 aprile dal Presidente Obama.
E in un’altra capacità significativa dal punto di vista della ricerca, i ricercatori sono ora in grado di eliminare il cervello chiarito, eliminare gli anticorpi fluorescenti e ripetere nuovamente il processo di colorazione utilizzando anticorpi diversi per esplorare diversi bersagli molecolari nello stesso cervello. Questo processo di colorazione / decolorazione può essere ripetuto più volte, hanno mostrato gli autori, e i diversi set di dati allineati tra loro.
Aprire la porta
LA CHIAREZZA ha quindi permesso di eseguire analisi altamente dettagliate e fine-strutturali su cervelli intatti — anche tessuti umani che sono stati conservati per molti anni, ha mostrato il team. Trasformare il cervello umano in campioni trasparenti ma stabili con cablaggio accessibile e dettagli molecolari può fornire una migliore comprensione delle basi strutturali della funzione cerebrale e della malattia.
Vista tridimensionale dell’ippocampo macchiato che mostra neuroni che esprimono fluorescenza (verde), connettono interneuroni (rosso) e supportano la glia (blu).
Al di là del beneficio immediato e apparente per le neuroscienze, Deisseroth ha avvertito che la CHIAREZZA ha scavalcato la nostra capacità di trattare i dati. “Trasformare enormi quantità di dati in informazioni utili pone immense sfide computazionali che dovranno essere affrontate. Dovremo sviluppare approcci computazionali migliorati alla segmentazione delle immagini, alla registrazione delle immagini 3D, al tracciamento automatico e all’acquisizione delle immagini”, ha affermato.
In effetti, tali pressioni aumenteranno man mano che la CHIAREZZA potrebbe iniziare a supportare una comprensione più profonda di sistemi e organi biologici intatti su larga scala, forse anche interi organismi.
“Di particolare interesse per lo studio futuro sono le relazioni intrasistemiche, non solo nel cervello dei mammiferi ma anche in altri tessuti o malattie per le quali la piena comprensione è possibile solo quando è possibile condurre un’analisi approfondita di sistemi singoli e intatti”, ha detto Deisseroth. “LA chiarezza può essere applicabile a qualsiasi sistema biologico, e sarà interessante vedere come altri rami della biologia possono metterlo in uso.”
Altri coautori includono la studentessa universitaria Jenelle Wallace; laureato studentsSung-Yon Kim, Kelly Zalocusky, Joanna Mattis, Aleksandra Denisin e Logan Grosenick; assistenti di ricerca Sandhiya Kalyanasundaram, Julie Mirzabekov, Sally Pak e Charu Ramakrishnan; borsisti post-dottorato Aaron Andalman, Dottorato di ricerca, e Tom Davidson, PhD; ex studente di Hannah Bernstein; e l’ex scienziato di personale Viviana Gradinaru.
La ricerca è stata sostenuta dal National Institute of Mental Health( grant MH099647); la National Science Foundation; la Fondazione Simons; il Presidente e Prevosto della Stanford University; le fondazioni Wiegers, Snyder, Reeves, Gatsby e Yu; il programma di riparazione DARPA; e il Fondo Burroughs Wellcome.
Anche il Dipartimento di Bioingegneria di Stanford ha sostenuto il lavoro. Il dipartimento è gestito congiuntamente dalla Scuola di Ingegneria e dalla Scuola di Medicina.
