Pittura cromosomica
8 Territori cromosomici
Piuttosto che essere dispersi in tutto il nucleo, ogni cromosoma occupa un volume distinto, chiamato territorio cromosomico. Ciò è stato dimostrato dalla pittura cromosomica, una tecnica a base di PESCE in cui il genoma viene ibridato con un gran numero di sonde specifiche per cromosomi per consentire la visualizzazione di singoli cromosomi all’interno del nucleo. Il posizionamento radiale di un cromosoma è fortemente influenzato dalla sua composizione: i cromosomi poveri di geni tendono ad occupare posizioni più vicine alla periferia nucleare, mentre i cromosomi ricchi di geni si trovano più frequentemente verso l’interno . Questa tendenza è illustrata dai cromosomi umani 18 e 19, che sono molto simili nelle dimensioni ma hanno una composizione di sequenza molto diversa: il cromosoma 18 è povero di geni, mentre 19 è ricco di geni. Il laboratorio Bickmore ha utilizzato cromosoma territory FISH per studiare le posizioni dei due cromosomi nel nucleo e ha scoperto che il cromosoma 18 si trovava costantemente più vicino alla periferia nucleare rispetto al cromosoma 19 in entrambe le linee cellulari linfoblastoidi e fibroblasti . Il posizionamento radiale dei cromosomi nel nucleo è stato anche trovato per essere tessuto specifico, con tipi di cellule più strettamente correlati esibendo posizionamento cromosomico più simile . Il genoma umano contiene anche cinque cromosomi acrocentrici, contenenti sequenze di rDNA—cromosomi 13, 14, 15, 21 e 22 che di solito sono raggruppati attorno al nucleolo-il sito di trascrizione e lavorazione dell’RNA ribosomiale.
La regola radiale del posizionamento cromosomico influenza anche il posizionamento di segmenti alternati ricchi di geni e poveri di geni all’interno dei cromosomi-in questo caso, i segmenti ricchi di geni si trovano più centralmente, mentre le regioni povere di geni occupano regioni più vicine alla periferia. Inoltre, all’interno dei territori cromosomici, i segmenti trascrizionalmente inattivi si trovano internamente e i segmenti trascrizionalmente attivi si trovano sulla superficie del territorio . Questa disposizione permette l’accesso pronto trascrizionalmente attivo delle regioni al macchinario della trascrizione ed ai domini ricchi di fattori metabolici del mRNA quali i fuochi SC-35 . Tuttavia, la struttura fine-dettaglio dei territori cromosomici è ancora poco chiara, riflettendo la nostra mancanza di conoscenza delle strutture della cromatina che li modellano.
Dal punto di vista della stabilità del genoma, un’importante conseguenza dei modelli di posizionamento cromosomico riguarda le traslocazioni, l’anomalia cromosomica più frequente osservata all’interno della popolazione umana. È ben stabilito che la vicinanza fisica di due cromosomi nel nucleo influisce sulla probabilità che si verifichi una traslocazione tra di loro (Fig. 23.3).
Figura 23.3. Le posizioni preferite dei cromosomi nel nucleo influenzano la frequenza di traslocazione.
I cromosomi con la stessa posizione radiale preferita nel nucleo (ad esempio, i cromosomi 17 e 19) hanno maggiori probabilità di essere coinvolti nelle traslocazioni rispetto ai cromosomi con posizioni radiali diverse (ad esempio, i cromosomi 17 e 18).
Un’analisi tra le frequenze di diverse traslocazioni non patogene nella popolazione umana e le posizioni radiali preferite dei cromosomi nel nucleo ha scoperto che cromosomi con posizioni nucleari simili formano traslocazionipiù frequentemente di quanto previsto per caso . Un altro studio è stato in grado di dimostrare la vicinanza tra BCR e loci ABL, coinvolti nella traslocazione t(9; 22) ben caratterizzata che forma un cromosoma “Philadelphia” nella leucemia mieloide cronica. Gli autori hanno dimostrato che i loci BCR e ABL erano più vicini nei linfociti B che nelle cellule progenitrici ematopoietiche, suggerendo che gli aspetti specifici del tipo cellulare dell’organizzazione nucleare possono contribuire all’associazione di alcune traslocazioni con particolari tipi di cancro. Nel 2013, il Misteli lab ha pubblicato uno studio che esplora le dinamiche delle rotture a doppio filamento e la successiva formazione di traslocazione in un sistema elegante: le cellule NIH3T3duo codificano un piccolo numero di siti enzimatici di restrizione SceI integrati su diversi cromosomi, con alcuni siti adiacenti a un array LacO e altri siti vicini a un array TetO. Dopo l’induzione della rottura da parte dell’enzima SceI, è stato possibile tracciare le interruzioni contrassegnate da proteine repressor Lac (LacR) e Tet (TetR) con marcatura fluorescente; la formazione di traslocazione è stata indicata da una co-localizzazione stabile e duratura dei segnali LacR e TetR. Gli autori sono stati in grado di dimostrare che la maggior parte delle traslocazioni sono formate da loci che si trovano strettamente prima dell’induzione della rottura (modello contact-first), piuttosto che come risultato di un movimento di rotture a doppio filamento in posizioni prossimali (modello breaktion-first).
Oltre ai metodi di analisi dei territori cromosomici, vengono utilizzati due principali metodi complementari per studiare l’organizzazione 3D del genoma a livello di struttura di dominio di ordine superiore: Metodi a base di PESCE e metodi di cattura della conferma cromosomica . FISH si basa sull’ibridazione di sonde etichettate in modo fluorescente per visualizzare loci individuali, porzioni definite del genoma o cromosomi interi. Fornisce un’istantanea della struttura nucleare a livello di singola cella, ma gli svantaggi sono che richiede molto tempo e fornisce una quantità limitata di informazioni a bassa risoluzione. Le tecniche di cattura della conformazione della cromatina (3C) si basano sul “congelamento” della struttura nucleare mediante interazioni di cross-linking all’interno del nucleo, legando frammenti di DNA tenuti in prossimità dai cross-link, seguiti da PCR o sequenziamento di nuova generazione per identificare frammenti di DNA ibridi, indicativi di contatti. Alla fine più sofisticata, queste tecniche possono teoricamente identificare tutte le possibili interazioni in tutto il genoma, ma ci sono anche degli svantaggi. A differenza del PESCE, le tecniche 3C lavorano su popolazioni di cellule piuttosto che a livello di una singola cellula, producendo una media di popolazione che può riflettere una serie di diverse configurazioni di contatto a livello di singola cellula. Nonostante le avvertenze, le metodologie 3C sono state molto influenti nel campo dell’organizzazione del genoma 3D, contribuendo al concetto di associazione topologica dei domini (TAD). I TAD sono definiti come regioni che misurano ∼900 kb, in cui le mappe di contatto mostrano interazioni aumentate; Gli studi basati a PESCE hanno indicato che le sonde situate all’interno di un TAD sono fisicamente più vicine delle sonde non situate all’interno dello stesso TAD ma separate da una simile distanza genomica “lineare”. Il genoma umano completo è diviso in circa 2000 TAD che si sovrappongono anche con la distribuzione di segni di istoni e altre caratteristiche genomiche come i tempi di replicazione (descritti più avanti). Tuttavia, non sono specifici del tipo cellulare e la questione del livello di organizzazione strutturale che riflettono e della loro importanza funzionale è ancora aperta al dibattito. È interessante notare che il modello di frequenza di traslocazione visto con i territori cromosomici può essere rintracciato anche al livello TAD di organizzazione – uno studio condotto su cellule B ha rilevato che la probabilità di traslocazione tra due loci è fortemente correlata alla frequenza di contatto tra di loro, come definito dalle mappe di contatto generate dalla cattura della conferma cromosomica .
