Infettive necrotico epatite causata da Clostridiumnovyi di tipo B in un cavallo: case report e revisione della theliterature | Jiotower

Infettive epatite necrotica (INH) è causata da Clostridium novyitype B. La malattia di solito colpisce le pecore, in cui è indicato anche come”black malattia” data la colorazione scura del tessuto sottocutaneo, causata byintense congestione venosa visto in carcasse di animali morti per questa malattia.6 Sebbene si pensi che l’INH si verifichi anche in altre specie, tra cui bovini, capre e cavalli, sono disponibili informazioni molto limitate su questa malattia inanimali diversi dalle pecore.2,3,19,15 Inoltre,a causa della sua rigorosa natura anaerobica, l’isolamento e l’identificazione di C. novyi tipo B è raramente raggiunto.15 Per questo motivo, i rapporti di INH sono comunemente limitati alla presuntivediagnosi basata su istopatologia, test degli anticorpi fluorescenti (FAT) e/orimmunoistochimica (IHC). Il tipo di C. novyi è raramentedeterminato. Qui presentiamo un caso confermato di INH equino causato da C.novyi tipo B, e anche rivedere la letteratura sulla malattia.

Un castrone di cavallo bay Quarter di 14 anni e 511 kg è stato sottoposto al San Bernardinobranch del California Animal Health and Food Safety Laboratory System forpostmortem examination and diagnostic workup. L’animale aveva una storia 3d di segni neurologici progressivi, temperatura rettale di 38,8-40,5°C e era stato trattato senza successo con farmaci antinfiammatori non steroidei, prima della morte.Un’autopsia completa è stata eseguita ~ 6 h dopo la morte.

All’autopsia, il cavallo era in buone condizioni nutrizionali, con un’adeguata quantità di riserve di grasso e in moderato stato di decomposizione post mortem. C’era giallodiscolorazione della sclera, del tessuto sottocutaneo e adiposo e articolarcartilages. Le emorragie multifocali da ecchimotico a suffusivo erano presenti nella maggior partemuscoli, sierosa del tratto intestinale, mesentere, milza, pleura e muscoli inpapillari del cuore. Il sangue venoso era rosso-nero intenso. Il pericardialsac era disteso con una grande quantità di liquido sierosanguineo e c’erano ~5L di un fluido simile contenente abbondanti filamenti di fibrina nella cavità addominale.Il fegato era marcatamente ingrandito e aveva bordi arrotondati; il lobo sinistro era fermo, da rosso scuro a nero, e aveva numerose bolle di gas subcapsulari e parenchimali profonde e abbondante fibrina sulla capsula (Fig. 1 BIS). Sulla sezione tagliata di questo lobo, c’era un diametro di ~ 15 cm, un’area pallida circondata da un sottile bordo emorragico (Fig. 1 TER). Le meningesoverlying il cervello e il midollo spinale erano diffusamente congestionate, e c’eranoemorragie epetechial in tutta la corteccia cerebrale. Nessun altro grosslesions significativo è stato osservato nel resto della carcassa.

Campioni di cervello, polmone, cuore, diaframma, fegato, milza, stomaco, intestino,pancreas, ghiandole surrenali, mesentere, rene e vescica urinaria sono stati raccolti andfixed nel 10% formalina tamponata (pH 7.2) per 48 h e trattati di routine per theproduction di 4 µm con spessore di ematossilina ed eosina (H&E) tinto sezioni. Anche le sezioni del fegato e dei reni sono state macchiate con macchie di Gram e Okajima,rispettivamente.

Campioni di fegato sono stati raccolti in modo asettico e sottoposti a aerobica e anaerobicultura su piastre di agar ovino al 5% per 48 h. La PCR è stata effettuata per il virus del Nilo occidentale (WNV)su campioni aggregati del sistema nervoso centrale e per l’herpesvirus equid 1 (EHV-1) su un tampone nasale. Su campioni di fegato è stato eseguito uno schermo di metalli pesanti tra cui piombo, manganese, ferro, mercurio,arsenico, molibdeno, zinco, rame e cadmio.Il liquido cerebrospinale è stato testato per gli anticorpi contro Sarcocystisneurona utilizzando un GRASSO indiretto. Gli strisci di fegato sono stati elaborati da FATfor Clostridium chauvoei,Clostridium septicum, Clostridium sordelli e C. novyi usando coniugati commerciali (VMRD, Pullman, WA). Inoltre,le sezioni di fegato fissate alla formalina e incorporate in paraffina sono state elaborate da un immunoperoxidasetechnique indiretto per C. novyi, utilizzando un kit commerciale (RTU VECTASTAINElite ABC system, Vector Laboratories, Burlingame, CA). L’attività di perossidasi endogena è stata estinta con una soluzione di perossido di idrogeno al 3%, seguita da pepsintreatment per il recupero dell’antigene. I campioni sono stati quindi incubati con BackgroundPunisher (Biocare Medical, Concord, CA) per bloccare il legame aspecifico, prima di incubare con anticorpo policlonale anti–C. novyi di capra (VMRD) a37°C per 60 min. Vector Novared chromogen è stato utilizzato per la visualizzazione (VectorLaboratories). Sezioni di fegato incubate con siero di capra normale invece dianticorpi primari sono stati usati come controllo negativo. Fegato da una mucca in cuic. novyi era stato identificato dalla cultura, e PCR è stato usatocome un controllo positivo.

I campioni di fegato sono stati elaborati per l’estrazione del DNA (QIAamp DNA FFPE tissue kit, Qiagen,Hilden, Germania) seguendo le istruzioni del produttore. Il DNA estratto è stato utilizzato come modello per un test PCR multiplex per amplificare i segmenti dei flagellingeni (fliC) di C. septicum, C. novyi tipo A, C. novyi tipo B, C. chauvoei, e Clostridium haemolyticum, come descritto in precedenza.17 Inoltre, abbiamo sviluppato una PCR convenzionale per amplificare un segmento di theC. gene della tossina alfa di tipo B (TcnA) di novyi(GenBank accession JENV01000127.1), il principale fattore di virulenza di questomicrorganismo. Sono state progettate le seguenti sequenze oligonucleotidiche: 5 ‘- TGATGTTGACCATCCTTGCTCT-3′(CNtBaF) e 5’-CCTTATGCAAAGGGATGGCG-3 ‘ (CNtBaR),che amplificano un frammento di DNA ~342-bp del gene bersaglio. La PCR convenzionale è stataeseguita in un volume totale di 25 µL contenente 5 µL di DNA estratto, 0.25 µL di ogni primer (10 µM), 7 µL di acqua priva di nucleasi e 12,5 µL di PCR Master Mix(2X, Promega, Madison, WI), contenente Taq DNA polimerasi (pH 8,5, 50 U/mL), dNTPs(400 µM) e MgCl2 (3 mM). I profili del termociclatore erano i seguenti:94 ° C per 5 min, 30 cicli di 94 ° C per 1 min, 55°C per 1 min e 72°C per 1,5 min,seguiti da una fase di estensione finale a 72°C per 7 min. I campioni sono stati tenuti a 4 ° Cuntil le reazioni PCR sono state visualizzate sotto la luce ultravioletta in etidiombromuro (Amresco, Solon, OH)-macchiato 1% gel di agarosio (Agarose SFR, Amresco). DNAESTRATTO da C. le colture di novyi tipo B (ATCC 25758), C. novyi tipo A, C. septicum, C. chauvoei e C. haemolyticum sono state utilizzate come controlli positivi. L’acqua invece del DNA è stata utilizzata nel controllo negativoreazioni.

Microscopicamente, la capsula epatica era coperta da abbondante fibrina mescolata a celldebris, e c’erano bolle enfisematose subcapsulari e parenchimali profonde di varie dimensioni. Il risultato più sorprendente era multifocale a necrosi coagulativa focalmente estensivecoagulative, circondato da un bordo di un gran numero di neutrofili anddegenerate vitali, emorragia, fibrina, detriti cellulari, e grandi aggregati ofgram-positivi bastoncelli batterici, alcuni dei quali avevano spore subterminali (Fig. 1 QUATER, D).D). Nell’interventoparenchima e nel fegato meno colpito, c’era stasi biliare, emorragie multifocaliche e necrosi fibrinoide segmentale-diffusa dei vasi sanguigni, molti diche contenevano anche trombi di fibrina. L’epitelio tubulare renale presentava una lieve vacuolazione citoplasmatica e nei tubuli renali lumenof erano presenti calchi proteici e granulari. I calchi macchiati positivamente con la macchia Okajima (Fig. 1E). Nel cervello, c’era congestione diffusa, perivascolareemorragie multifocali e sparse casualmente e espansione da moderata a marcata dello spazio Virchow-Robin conedema acidofilo. Il peritoneo viscerale era coperto da abbondante fibrina mescolata con un gran numero di neutrofili vitali e degenerati; la maggior parte dei vasi sanguigni peritoneali erano congestionati e/o contenevano trombi di fibrina. Alcune piccole arterie evene nella corteccia e nel midollo della ghiandola surrenale avevano anche trombi di fibrina. Thespleen aveva congestione vascolare e multifocali parenchimale e capsularhemorrhages. I polmoni erano diffusamente congestionati e presentavano emorragie multifocali ededema, oltre ad alcuni vasi sanguigni contenenti trombi di fibrina. Sono state osservate emorragie multiplesubendocardiche, subepicardiche e subpleuriche.

La grande maggioranza dei bastoncelli gram-positivi intralesionali osservati nel fegato erano positivi per C. novyi IHC (Fig. 1F). Il grasso era positivo per C.novyi, ma negativo per le altre specie clostridiali testate. I campioni di livers erano positivi per i geni FLIC e TcnA di tipo C. novyi e negativi per i geni fliC degli altri clostridi testati (Fig. 2). I campioni di liquido cerebrospinale sono risultati negativi al test degli anticorpi immunofluorescenti S. neurona. La PCR per WNV e EHV-1 eranegativo. Nessuna crescita batterica significativa è stata raggiunta da aerobic o anaerobicculture. Lo schermo di metalli pesanti ha rivelato un’elevata concentrazione di campioni di ferro inliver (1.500 ppm; intervallo di riferimento: 100-300 ppm).

Abbiamo fatto una diagnosi presuntiva di INH basata su cambiamenti grossolani e microscopici, insieme ai risultati di FAT e IHC per C. novyi. La diagnosi di INH prodotta da C. novyi tipo B è stata confermata dalla rilevazione PCR dei geni fliC e TcnA di questomicrorganismo. A nostra conoscenza, sono stati segnalati solo 6 casi di sospetta ihnprecedentemente nei cavalli. Tre casi si sono verificati in Australia,8, 9,11 e uno ciascuno in Nuova Zelanda,23 Scozia, 19 e Stati Uniti (Montana).16 In questi casi, una diagnosi presuntiva era basata su gross e microscopiclesions accoppiati con rilevamento di C. novyi da FAT,9,16,19 IHC,23 e/o cultura.9,19 Tuttavia, il tipo di C. novyiinvolto non è stato determinato in nessuno di questi casi.

C. novyi è un bacillo anaerobico gram-positivo, spore-formante, che si trova comunemente nel suolo e nelle feci degli animali.15 È classificato in tipi A, B e C in base alla gamma di tossine prodotte.4 QUATER. novyi tipo A produce principalmente l’alfatossina letale che induce edema (TcnA) e la fosfolipasi non letale, la tossina gamma; questo batterio è associato alla cancrena gassosa dell’uomo e degli animali, che di solito agisce insieme ad altri clostridi. C. novyi tipo B produce anche TcnA, oltre alla tossina beta necrotizzante ed emolitica, sebbene la prima sia considerata il fattore di virulenza più importante per la patogenesi dell’INH. C. novyi tipo C è considerato non tossico enon patogeno.13,15 C. haemolyticum era precedentemente noto come C. novyitype D, ed è ancora indicato con questo nome da alcuni autori; quindi, noicosì discuti questo microrganismo qui. C. haemolyticum produce anche la tossina beta,ma in quantità molto maggiori di C. novyitype B; questa tossina è considerata il principale fattore di virulenza di questo microrganismo ed è responsabile dell’emoglobinuria bacillare (BH), una malattia che colpisce principalmente i bovini che è clinicamente e patologicamente molto simile all’INH.11,10,14

Le spore di C. i novyi sono altamente resistenti alle condizioni ambientali e, dato che le spore si trovano comunemente nel suolo, gli animali al pascolo possono ingerirli frequentemente.6,19 Sebbene non completamente provato, il dogma attuale è che, dopo l’ingestione, le spore di C. novyi tipo B vengono assorbite dall’intestino e raggiungono il fegato attraverso la circolazione portale, dopo di che si diffondono ad altri organi. Le spore sono fagocitate e rimangono latenti nelle Kupffercellule del fegato e nei macrofagi della milza e del midollo osseo.2,6 INH hascommonly è stato considerato come la controparte di BH perché ambo le malattie arebelieved per accadere dopo danno epatico, causante la necrosi e le condizioni anaerobic associate che sono richieste per germinazione di spore latenti e theproduction di tossine.14 Migrazione di forme immature di Fasciola hepaticail fegato è considerato il fattore predisponente più importante sia per i ruminanti BH che INHin, ed entrambe le malattie sono più comuni nelle aree con alta prevalenza di fascioliasi.1 INH dei ruminanti è stato anche associato con Cisticercustenuicollis e altri parassiti, tra cui Fascioloidesmagna, Dicrocoelium dendriticum,Ethysanosoma actinoides,2,6,15, 21 sebbene il ruolo di questi parassiti nella patogenesi della malattia non sia stato dimostrato.Tuttavia, qualsiasi danno epatico che porti alla generazione di condizioni anaerobiche può essere un fattore determinante per l’INH. Questi includono, ma non sono limitati a, liverabscesses, biopsie, cambiamento grasso, telangiectasia e agenti tossici. Una volta che TcnA èprodotto e rilasciato dalle forme vegetative di C. novyi tipo B, la sua attività monoglicosil transferasi inattiva diverse proteine guanosin5 ‘ -trifosfato (GTP) – leganti nelle cellule dell’ospite, risultando inalterazione e ridistribuzione del citoscheletro di actina.3 TcnA interrompe anche il sistema di vimentina e tubulina.7,18 Questi cambiamenti sembrano essere più drammatici nell’endotelio capillare, portando allo stravaso fluido diffuso visto in INH15 e probabilmente alla trombosi multisistemica osservata nel cavallo del nostro rapporto. Nelle pecore, la natura altamente acuta della malattia rende difficile la rilevazionesegni clinici, con animali di solito trovati morti. Nei casi in cui i segnisono osservati, sono non specifici e includono debolezza, letargia, anoressia, ipertermia,tachipnea, iperpnea e infine recumbency. I cambiamenti clinici possono includere neutrofilia con spostamento a sinistra, azotemia,acidosi metabolica e attività enzimatiche epatiche e muscolari elevate.15,19

Dato che solo 6 casi di INH presuntivo sono stati descritti in precedenza nei cavalli,le informazioni epidemiologiche, cliniche e patologiche disponibili sono scarse. Sulla base di questo numero limitato di casi, non vi è alcuna apparente predisposizione al sesso o alla razza nei casi di INH equino e possono essere colpiti sia animali giovani che adulti. Il decorso clinico è solitamente più lungo nei cavalli che nei ruminanti, della durata di 12-72 h, e il risultato è sempre stato fatale. I segni clinici variano da lieve a severedepression e riluttanza a muoversi, segni neurologici tra cui atassia e headtilt, iperemica e / o itterici mucose e sclera oculare, dolore addominale, e recumbency.20,23 In un caso in cui è stata eseguita l’addominocentesi,è stata ottenuta una maggiore quantità di liquido torbido con elevata concentrazione proteica eè stata ottenuta gravità specifica.9

I profili clinicopatologici dei cavalli con INH sono altamente variabili e possono rappresentare diversi stadi di tossiemia e danno epatico. Queste alterazioni mayinclude neutrofilia con uno spostamento sinistro, attività enzimatica epatica elevata, trombocitopenia, iperfibrinogenemia, iperbilirubinemia, e decreasedconcentration di elettroliti.9,16,19 Inoltre, sono stati riportati tempi di tromboplastina parziale attivata, protrombina e trombina aumentati.23 Questi cambiamenti, in combinazione con i microtrombi capillari osservati, sono suggeritivi della coagulazione intravascolare disseminata, un processo che probabilmente si verificadurante il decorso della tossiemia e dell’emolisi in animali di grandi dimensioni.22,23 Il conseguente consumo di fattori della coagulazione, la loro ridotta sintesi a causa dell’insufficienza epatica e l’azione sinergica del TcnA sull’endotelio vascolare sono responsabili delle emorragie diffuse osservate nei casi diINH.

Sebbene l’ittero non sia descritto nei ruminanti, i cavalli possono talvolta presentare questo segno associato all’INH.19,23 Ittero sembra essere correlato alla gravità didanno epatico e, in una certa misura, all’emolisi, come nel nostro caso, in cuil’emoglobina è stata visualizzata nei tubuli renali dalla macchia di Okajima. Il cavallo nel nostro studio aveva una concentrazione di ferro moderatamente aumentata nel fegato, indicativa di un processo emolitico.5 Questo livello di ferro nel fegato è, tuttavia, un reperto comune nei cavalli da una varietà di cause ed è spesso considerato un reperto incidentale associato alla congestione e all’autolisi post-mortem (osservazione non pubblicata degli autori).

Sebbene si possa ipotizzare che i cavalli siano più sensibili di altre specieall’azione della tossina beta emolitica prodotta da C. novyitype B, i cambiamenti emoglobinurici non sono stati descritti in casi presuntivi diINH.16,23 Rispetto a C. haemolyticum, C. novyi tipo B produce livelli più bassi di tossina beta;15 pertanto, si presume che il suo contributo alla patogenesi di INH sia beminor, causando un certo grado di emolisi nei cavalli, ma non abbastanza da indurre significativi cambiamenti associati all’emoglobinuria. Inoltre, nessuno dei casi precedenti escludeva il ruolo del C. haemolyticum come agente causale della malattia, pertanto non è possibile trarre conclusioni definitive da tali casi. C. haemolyticum è stato implicato in un caso di peritonite settica ina mare mediante identificazione con MALDI-TOF; tuttavia, PCR o identificazione tossina wasnot tentato in quel caso particolare.11

Il fattore predisponente per l’INH nei cavalli non è sempre stato determinato, sebbene siano state suggerite le migrazioni epatiche di F. hepatica e dei relativi trematodi, nonché dei membri della famiglia Strongylidae.9,12,19 Inoltre, il trattamento antielmintico prima dell’insieme dei segni clinici è stato suggerito come potenziale innesco della malattia,9,16, 23 presumibilmente causando un certo grado di necrosi epatica associata alla distruzione dei parassiti migratori. Tuttavia, nessuna prova scientifica è disponibile per supportare questa ipotesi. Sfortunatamente, non notoi fattori previsionali sono stati determinati nel nostro caso.

Come nel nostro caso, la maggior parte dei rapporti precedenti descriveva un singolo (multiplo in un caso19) focus di necrosi che colpisce il fegato, costantemente localizzato nella sinistralobo. Questo contrasta con INH di pecore in cui distribuiti in modo casuale, smallnecrotic foci sono più comuni.6,15 La ragione di questola variazione nella distribuzione è sconosciuta. È possibile che la predominanza dilesioni sul lobo sinistro sia correlata al cosiddetto flusso portale, che èresponsabile del flusso differenziale di sangue portale a particolari lobi delfegato. Poiché C. novyi è presumibilmente assorbito dal piccolointestino, e il sangue da questo organo segue il flusso portale verso il lobo sinistro, questo può causare questo lobo prevalentemente influenzato.6 Assenza di alterazioni associate all’encefalopatia epatica (ad es.Alzheimer di tipo II astrocitosi associata a iperammonemia) 6 può suggerire che i segni neurologici in questo e nei casi precedenti eranoconseguenza di emorragie, congestione ed edema perivascolare notato nel cervello,correlato alla tossiemia e all’azione del TcnA sull’endotelio capillare.

INH dovrebbe essere nella lista delle diagnosi differenziali di cavalli con segni neurologici clinici, tossiemia, insufficienza epatica acuta e peritonite. Anche thoughtreatment con alte dosi di penicillina e tetracicline può essere efficace againstC. novyi, la produzione avanzata di tossine di solito risultain una prognosi infausta.19 Nelle aree in cui la malattia è chiaramente associata a trematodi epatici e/o altri parassiti, si può tentare di ridurre il carico parassitario e limitare l’accesso degli animali a pascoli scarsamente drenati come misure preventive.15

Dato che si presume che diverse malattie clostridiali siano associate alla decomposizione post mortem accelerata, una considerazione importante per la corretta diagnosi diINH è la necessità di una rapida valutazione e conservazione dei tessuti dopo la mortedell’animale.6,23 L’anamnesi clinica, l’autopsia di routine,l’istopatologia e l’immunotenenza di C. novyi nelle lesioni epatiche sono essenziali per fornire una diagnosi presuntiva di INH. Poiché l’isolamento non è sempre riuscito, dati i severi requisiti anaerobici del microrganismo, l’identificazione molecolare mediante PCR è uno strumento prezioso per fornire una diagnosi eziologica e per differenziare il tipo B di C. novyi da altri patogeni clostridiali.