Interpretare il test quantitativo del DNA citomegalovirus: comprendere la prospettiva di laboratorio | Jiotower
Caratteristiche dei test analitici
Esistono caratteristiche prestazionali dei test di carica virale che devono essere comprese per poter utilizzare e interpretare correttamente i risultati dei test. Questi includono il limite di rilevamento (LOD), LOQ inferiore e superiore, intervallo lineare, precisione (riproducibilità) e precisione. Il LOD, definito come la più bassa concentrazione di DNA che può essere rilevata nel 95% dei replicati, viene tipicamente utilizzato per test molecolari qualitativi; tuttavia, il termine può essere applicato anche ai test quantitativi di carica virale. I LOQ superiori e inferiori sono le concentrazioni più alte e più basse di DNA che possono essere quantificate con “precisione accettabile” . Attualmente, non esiste una definizione concordata per “precisione accettabile”; pertanto, i singoli laboratori definiscono questo localmente. Il modo in cui viene definita “precisione accettabile” può influenzare notevolmente il LOQ. Il LOD può essere equivalente al LOQ inferiore o può essere inferiore al LOQ inferiore. In quest’ultima situazione, il test può rilevare il DNA CMV, ma il valore non può essere quantificato con precisione. In questi casi, il laboratorio potrebbe segnalare il risultato come “rilevato ma al di sotto del LOQ”; alcuni laboratori riportano questo come “basso positivo.”Il laboratorio dovrebbe essere in grado di fornire sia il LOD che il LOQ; ad esempio, nel nostro laboratorio il LOD del test di carica virale CMV è di 100 copie/mL, mentre il LOQ è di 300 copie/mL. Dopo aver consultato i medici, è stata presa la decisione di riportare valori di 100-300 copie/mL come risultati “bassi positivi”, mentre quelli >300 copie/mL sono riportati come un valore intero.
Sebbene i test molecolari molto sensibili siano spesso importanti per la rilevazione di agenti patogeni infettivi, questo potrebbe non essere il caso dei test del DNA CMV. Il significato clinico di bassi livelli di CMV DNA (<100-500 copie/mL) può essere difficile da interpretare, in particolare se vengono testati campioni di sangue intero, perché bassi livelli di CMV DNA nel sangue intero o nel plasma non sempre sono correlati con lo sviluppo della malattia. Alcuni studi sono stati fatti per determinare la soglia per il trattamento, compreso uno studio di storia naturale della malattia di CMV nei destinatari del trapianto del fegato . Utilizzando il test COBAS Amplicor Monitor (Roche Molecular Diagnostics), gli autori hanno dimostrato che un valore di carica virale di 2000-5000 copie/mL correlato allo sviluppo della malattia dell’organo terminale. Questo valore limite dipende dal test e può essere superiore o inferiore per altri LDT. Gli studi hanno anche dimostrato che sia il valore della carica virale che il tasso di variazione della carica virale sono importanti predittori dello sviluppo della malattia attiva . Più veloce è il tasso di aumento del valore della carica virale, maggiore è il rischio di sviluppare la malattia da CMV. Una volta che i test sono ricalibrati con lo standard internazionale, è possibile identificare un LOD clinicamente rilevante universale e un LOQ inferiore. Sulla base dei dati e dell’esperienza attualmente disponibili, 250-500 UI/mL possono essere un LOD appropriato e/o un LOQ inferiore.
Dato che la maggior parte delle LDT utilizza tecnologie di reazione a catena della polimerasi in tempo reale, l’intervallo lineare dei test di carica virale del CMV è solitamente di almeno 6 log10; ad esempio, il test può rilevare da 2,0 log10 copie/mL (100 copie/mL) a 7,0 log10 copie/mL (10 milioni di copie/mL). Una revisione dei test di carica virale CMV eseguiti nel 2009 presso Emory Medical Laboratories ha mostrato che dei circa 8500 test di carica virale del DNA CMV eseguiti su campioni di plasma, 671 (7,9%) erano positivi. Di questi, 394 (58,7%) erano <1000 copie/ml, 169 (25,2%) erano tra 1000 e 10 000 copie/mL e 63 (9,4%) erano tra 10 000 e 100 000 copie/mL. Inoltre, 45 (6,7%) avevano una carica virale del DNA CMV di >100 000 copie/mL. Sebbene i bassi valori di carica virale siano comuni, il loro significato clinico non è chiaro. Valori di carica virale molto elevati sono rari e, quando si verificano, si osservano di solito in pazienti immunosoppressi con infezione primaria da CMV o in quelli con malattia molto grave. Poiché in alcuni individui possono essere presenti valori di carica virale fino a 10 milioni, il limite superiore di quantificazione di un test dovrebbe essere in questo intervallo.
L’interpretazione di importanti differenze nei valori di carica virale longitudinale in un singolo paziente richiede una comprensione della precisione o della riproducibilità del test. Tipicamente la variabilità dei test di carica virale è maggiore vicino al LOQ inferiore e superiore e più bassa nella gamma media del test. Di conseguenza, piccole variazioni nei valori di bassa carica virale non sono significative; ad esempio, non esiste una chiara differenza tra i risultati in un paziente in cui il valore di carica virale è aumentato da 200 copie/mL a 500 copie/mL perché questa differenza rientra nella variabilità del test. I dati più utili riguardanti cambiamenti clinicamente importanti nei valori di carica virale provengono dall’esperienza con HIV-1. Per questi test approvati dalla FDA, la variabilità del test varia da 0,1 copie log10 / mL a 0,2 copie log10 / mL, rispetto alla variabilità biologica osservata in individui non trattati con infezione cronica, che è di circa 0,3 copie log10/mL. Pertanto si ritiene che le variazioni della carica virale >0,5 log10 copie/mL rappresentino cambiamenti biologicamente importanti nella replicazione virale. Sebbene il valore di 0,5-log10 copie / mL sia stato ampiamente adottato per l’uso con molti altri agenti patogeni virali, potrebbe non essere accurato per CMV. Poiché la variazione biologica della CMV non è nota, sono stati storicamente valutati importanti cambiamenti nei valori di carica virale basati solo sulla variabilità del test. Ulteriori lavori con HIV-1 hanno mostrato che la SD del test doveva essere ≤0,15 log10 copie/mL per discernere variazioni di 5 volte nei valori della carica virale . Per CMV LDTS la variabilità del test dovrebbe essere migliore di quello che si vede per i test di carica virale HIV-1 approvati dalla FDA e potrebbe essere più alta, in particolare vicino al LOQ inferiore . Pertanto, quando si rilevano valori di carica virale CMV di < 1000 copie / mL, cambiamenti di < 5 volte (0.7 log10) raramente rifletterà cambiamenti clinicamente importanti nella replicazione virale. Per valori > 1000 copie / mL, le variazioni di 3 volte (0,5 log10) della carica virale possono essere significative, sebbene ciò possa differire tra le LDT. Alcuni centri riportano carichi virali come copie / mL e come copie log10 / mL perché i medici possono avere meno probabilità di sovrinterpretare piccoli cambiamenti nei valori di carica virale quando espressi come valori log10.
Un campione basale per il test della carica virale deve essere raccolto il giorno in cui viene iniziato il trattamento con CMV, anche se il test della carica virale CMV è stato eseguito alcuni giorni prima. Rapidi aumenti della carica virale del CMV possono verificarsi nell’arco di alcuni giorni nei pazienti con malattia non trattata, rendendo importante avere il valore della carica virale del CMV al momento del trattamento. Se i valori della carica virale superano il LOQ superiore, si raccomanda che il laboratorio diluisca il campione per determinare il valore effettivo della carica virale. Una volta iniziata la terapia, l’intervallo ideale per il monitoraggio è settimanale perché l’emivita del DNA CMV nel plasma è di 3-8 giorni . Un altro motivo per l’utilizzo di questo intervallo è che non è raro che la carica virale del DNA CMV aumenti in un paziente pochi giorni dopo l’inizio della terapia, e questo può essere interpretato erroneamente come fallimento del trattamento. Poiché i pazienti con DNA persistente nel plasma o nel sangue intero sono ad aumentato rischio di recidiva , le linee guida attuali raccomandano di continuare la terapia antivirale fino a quando i valori di carica virale non sono rilevabili. Alcuni pazienti hanno persistenti bassi livelli di DNA CMV nel plasma o nel sangue intero e non sviluppano mai malattie da CMV o recidive. In questi individui, è più utile seguire le tendenze dei valori di carica virale nel tempo piuttosto che valutare il significato di un dato valore di carica virale. Modelli di carica virale che sono preoccupanti per il virus resistente ai farmaci includono quelli che non diminuiscono dopo 2 settimane di terapia adeguata , quelli con un plateau nel tasso di declino della carica virale, e quelli che hanno un calo iniziale e poi un successivo aumento della carica virale durante la terapia. Questi pazienti devono essere valutati per la presenza di virus resistenti sequenziando i geni UL97 e/o UL54 (polimerasi) direttamente da un campione di plasma.
I test di carica virale del DNA CMV sono progettati in modo che non reagiscano in modo incrociato con altri herpesvirus. In un paziente immunocompromesso, il rilevamento di 2 herpesvirus, ad esempio CMV e virus di Epstein-Barr, riflette la riattivazione di entrambi i virus e non è dovuto alla reattività crociata.
