Arabidopsis cmt3 chromomethylase mutazioni blocco non-CG metilazione e silenziamento di un gene endogeno | Jiotower

Risultati e Discussione

Per identificare i fattori che controllano la metilazione e silenziamento del WS PAI geni, abbiamo isolato un mutante variante di WS, pai1C251Y, in cui il silenziamento di metilato di singoletto PAI2 gene può essere visualizzata l’intensità di un blu fluorescente impianto fenotipo sotto ultravioletta (UV) della luce (Bartee e Bender 2001). Nel ceppo pai1C251Y, le uniche potenziali fonti di attività enzimatica del PAI sono il gene PAI1, che è paralizzato da una mutazione missense, e il gene PAI2, che viene silenziato. A causa di questa carenza di PAI, il ceppo accumula intermedi fluorescenti della via del triptofano, oltre a mostrare pigmentazione delle foglie giallo-verde, dimensioni ridotte, maggiore cespugliosità e ridotta fertilità. Tuttavia, le mutazioni del secondo sito che alleviano il silenziamento di PAI2 sopprimeranno i fenotipi carenti di PAI (Bartee e Bender 2001). Così, abbiamo mutagenizzato il ceppo pai1C251Y e schermato per piantine con fenotipi fluorescenti deboli soppressi. Come schermo secondario, abbiamo testato la metilazione PAI mediante analisi Southern blot con enzimi di restrizione sensibili alla metilazione. In particolare, abbiamo analizzato la metilazione con gli isoschizomeri HpaII e MspI, che riconoscono la sequenza 5 ‘-CCGG-3’. HpaII è sensibile alla metilazione delle citosine interne (CG) e esterne (CNG), mentre MspI è sensibile solo alla metilazione delle citosine esterne. Questi enzimi si dividono una volta in ciascun locus WS PAI e rivelano sia la densità che il modello di metilazione per ciascun gene (Bender e Fink 1995; Luff et al. 1999; Melquist et al. 1999).

Da questa strategia di screening abbiamo isolato 11 alleli di perdita di funzione nel gene CMT3 (vedi sotto e Materiali e metodi). I mutanti cmt3 nello sfondo pai1C251Y mostravano una fluorescenza fortemente ridotta nello sviluppo precoce della piantina e una fluorescenza parzialmente ridotta nelle piante adulte, con aumento delle dimensioni, diminuzione della cespugliosità e aumento della fertilità (Fig. (Fico.1).1). Questi isolati fluorescenti intermedi cmt3 non sono tornati alla non fluorescenza, che è diagnostica della perdita di metilazione residua di PAI2 (Bender e Fink 1995), ad una frequenza rilevabile. Hanno mostrato una scissione parzialmente aumentata con HpaII e una scissione fortemente aumentata con MspI per i geni PAI rispetto ai genitori pai1C251Y (Fig. (Fico.2 BIS).2 BIS). Il modello di scissione ha suggerito che i mutanti cmt3 sono stati più colpiti nel mantenimento della metilazione CNG dei geni PAI. Per determinare se i mutanti cmt3 hanno influenzato anche la metilazione di una sequenza genomica altamente ripetuta, abbiamo riprogrammato l’HpaII / MspI Southern blot con una sonda alle sequenze di ripetizione associate al centromero (CEN) 180-bp (Vongs et al. 1993). Questa sonda ha rivelato scarso effetto sulla scissione HpaII ma ha aumentato la scissione MspI, coerente con il modello osservato per i geni PAI (Fig. (Fico.2 TER).2 TER). Un modello simile di aumento della scissione MspI è stato osservato anche al rDNA ripetuto (dati non mostrati). Tutti gli 11 alleli cmt3 testati avevano schemi di metilazione identici in questi saggi. Inoltre, quando gli alleli cmt3 sono stati separati dall’allele pai1C251Y in uno sfondo WS wild-type, hanno anche mostrato schemi di metilazione identici in questi saggi (Fig. (Fico.2).2). I modelli di metilazione PAI e CEN erano distinti dai modelli indotti dalle mutazioni caratterizzate ddm1 e met1 metilazione-carenti (Fig. (Fico.2; 2; Bartee e Bender 2001).

Per determinare con maggiore precisione i modelli di metilazione nello sfondo mutante cmt3, abbiamo eseguito il sequenziamento genomico dei modelli di metilazione nelle regioni del promotore PAI1 e PAI2 di un allele rappresentativo cmt3 utilizzando la mutagenesi del bisolfito di sodio (Frommer et al. 1992). Questa analisi ha rivelato che la maggior parte delle citosine metilate (87% in PAI1 e 70% in PAI2) si è verificata a residui di CG (Fig. (Fico.3; 3; Tabella Tabella1).1). Rispetto al promotore wild-type WS PAI1 (Luff et al. 1999; Tabella Table1), 1), La metilazione CG è stata ridotta del 34%, la metilazione CNG è stata eliminata e la metilazione asimmetrica è stata ridotta del 93%; nel promotore PAI2, la metilazione CG è stata ridotta dell ‘ 8%, la metilazione CNG è stata ridotta del 92% e la metilazione non CG è stata ridotta del 75%. Pertanto, la perdita della funzione CMT3 ha un forte effetto sul mantenimento del GNC e sulla metilazione asimmetrica e un effetto più debole sul mantenimento della metilazione CG. Questi risultati sono coerenti con i rapporti che Arabidopsis CMT3 e mais ZMET2 sono importanti per il mantenimento della metilazione CNG in vari siti genomici (Lindroth et al. 2001; Papa et al. 2001), ma mostrano ulteriormente che CMT3 è anche importante per il mantenimento della metilazione asimmetrica per i geni PAI. Questo risultato implica che CMT3 controlla direttamente sia la metilazione simmetrica che quella asimmetrica o che la riduzione della metilazione simmetrica nello sfondo mutante cmt3 causa una ridotta metilazione asimmetrica come conseguenza secondaria. Poiché le sequenze metilate nel promotore e nel primo esone del gene reporter PAI2 (bp 370 bp) contengono solo 16 motivi CG dispersi, la perdita di metilazione non CG ipometila significativamente questa regione del gene (Fig. (Fico.3), 3), che rappresentano l’espressione PAI2 migliorata nel mutante soppressore.

Il locus mutante cmt3 negli isolati soppressori cmt3 pai1C251Y è stato mappato da incroci con il ceppo polimorfico Nd-0, che ha una disposizione simile di geni PAI densamente metilati come trovato in WS (Melquist et al. 1999). F2 progenie con fenotipi debolmente fluorescenti diagnostica di omozigosi sia per pai1C251Y e cmt3 sono stati identificati mediante ispezione visiva sotto luce UV e confermato da MspI Southern blot per forte scissione PAI simile a quella osservata negli isolati soppressori parentali. Una popolazione di mappatura di piante F2 che soddisfaceva questi criteri è stata quindi utilizzata per segnare loci genomici legati al fenotipo soppresso. L’analisi di mappatura ha rivelato il legame con un singolo locus sul braccio inferiore del cromosoma 1. Poiché il gene della citosina metiltransferasi putativo CMT3 si mappa in questo locus, ci siamo concentrati su questo gene come candidato. All’interno di ogni popolazione di mappatura, abbiamo trovato un collegamento completo con un marker polimorfico che si trova entro 100 kb del gene CMT3. Per confermare che il gene CMT3 era in realtà il sito delle mutazioni soppressori di metilazione, abbiamo clonato e sequenziato il gene dagli isolati mutanti 11. Il sequenziamento ha rivelato un singolo cambiamento di base nella sequenza di codifica CMT3 in ogni isolato. Tre degli alleli mutanti hanno interessato aminoacidi assolutamente conservati nel dominio catalitico della metiltransferasi, incluso l’allele rappresentativo cmt3G456D utilizzato per il sequenziamento del bisolfito. Un altro allele è stato predetto per terminare prematuramente la proteina. Due alleli hanno creato mutazioni di giunzione di giunzione. I restanti cinque alleli hanno influenzato gli amminoacidi tra la metiltransferasi motif IV e il terminale C della proteina che sono altamente conservati tra i geni CMT (Fig. (Fico.4).4).

Per confermare ulteriormente che il gene CMT3 era il locus mutante, abbiamo trasformato gli isolati pai1C251Y cmt3 con un clone genomico WS wild-type del gene CMT3. Le piantine trasformanti erano fortemente fluorescenti, in modo simile a quelle del ceppo pai1C251Y (Fig. (Fico.1).1). Le linee trasformanti analizzate dall’analisi Southern blot nella generazione T2 hanno mostrato la remetilazione del gene PAI2 ai livelli osservati nel ceppo originale pai1C251Y (dati non mostrati). Pertanto, il gene CMT3 clonato potrebbe integrare i difetti di metilazione mutante. Come controllo, il mutante rappresentativo pai1C251Y cmt3G456D è stato anche trasformato con un clone genomico WS wild-type del gene CMT2. Le piantine trasformanti CMT2 erano debolmente fluorescenti, in modo simile a quelle del ceppo parentale non trasformato (Fig. (Fico.1), 1) e non ha mostrato la remetilazione rilevabile di PAI2. Questa analisi mostra che CMT2 non può sostituire la funzione CMT3. A questo proposito, è interessante notare che CMT2 differisce da CMT3 principalmente nella sua sequenza N-terminale (Fig. (Fico.44).

Ceppi Arabidopsis precedentemente caratterizzati da carenza di metilazione con difetti nel gene DDM1 correlato al fattore di rimodellamento della cromatina SWI2/SNF2 (Jeddeloh et al. 1999) o il gene MET1 della citosina metiltransferasi correlato a Dnmt1 mostra anomalie progressive dello sviluppo (Finnegan et al. 1996; Kakutani et al. 1996; Ronemus et al. 1996). La nostra analisi preliminare dei ceppi pai1C251Y cmt3 di sei generazioni e cmt3 di due generazioni non ha rivelato alcuna evidente segregazione dei cambiamenti morfologici. Questa differenza tra cmt3 e altri mutanti carenti di metilazione è probabile che rifletta il fatto che la metilazione CG viene mantenuta in misura maggiore in cmt3 rispetto a ddm1 o met1 (Fig. (Fico.2; 2; Bartee e Bender 2001). Poiché molti dei siti metilati endogeni nel genoma di Arabidopsis, come le ripetizioni CEN (Fig. (Fico.2; 2; Vongs et al. 1993; Lindroth et al. 2001), e il promotore del gene omeo-dominio FWA (Soppe et al. 2000; Lindroth et al. 2001), portano principalmente metilazione CG, mutazioni cmt3 non ci si aspetterebbe di influenzare fortemente questi loci. Invece, CMT3 molto probabilmente agisce come una metilasi di rinforzo che aggiunge un ulteriore strato di metilazione a particolari regioni genomiche come i geni PAI, in cui l’aumento della densità di metilazione porta ad un aumento del silenziamento. Un modello specifico è che lo strato basale di metilazione CG fornito da altre funzioni come MET1 potrebbe servire da guida per CMT3, che decorerebbe quindi lo strato basale con metilazione extra CG e non CG. Il reclutamento di CMT3 in regioni mirate potrebbe coinvolgere le interazioni della proteina della cromatina con il motivo cromodominio (Henikoff e Comai 1998), insieme alle interazioni mediate dalle sequenze N-terminali uniche.

Perché funghi come Neurospora crassa e Ascobolus immersus possono mantenere la metilazione non CG (Selker et al. 1993; Goyon et al. 1994), questi organismi potrebbero codificare i geni CMT. Al contrario, poiché animali come gli esseri umani e i topi mancano di metilazione non CG, si prevede che questi organismi manchino di geni CMT, come nel caso delle analisi degli attuali database di sequenze. L’apparente mancanza di metilasi simili a CMT nei genomi animali (Finnegan e Kovac 2000) suggerisce che gli animali hanno evoluto meccanismi alternativi per rafforzare gli stati di cromatina.