Prevalenza e Alcuni Possibili Meccanismi di Resistenza alla Colistina Tra Multidrug-Resistente ed Estensivamente Resistente ai farmaci Pseudomonas aeruginosa

Introduzione

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) è un patogeno opportunista, che si trovano comunemente in un ambiente come il suolo, l’acqua, le piante e l’ambiente ospedaliero, con nota intrinseca resistenza agli antimicrobici e la capacità di causare infezioni life-threatening. È considerata la seconda causa comune di sepsi nelle unità di terapia intensiva (ICU) e può causare polmonite associata al ventilatore, infezioni della ferita e infezioni del tratto urinario (UTI). Molti studi hanno riportato l’aumento della mortalità e della morbilità delle infezioni associate a P. aeruginosa, specialmente quelle che mostrano modelli di resistenza multi-farmaco.1-3

L’emergere di multiresistente (MDR) o estesamente farmaco-resistente (XDR) o pandrug-resistente (PDR) P. aeruginosa diventa un problema di salute pubblica significativo che può portare a una terapia antimicrobica ritardata o al suo fallimento e all’aumento del tasso di mortalità, specialmente con la comparsa di P. aeruginosa resistente ai carbapenemi. Quindi, è necessaria attenzione perché questi ceppi resistenti possono mostrare resistenza a tutti gli antimicrobici disponibili o hanno mostrato suscettibilità solo a quelli tossici come colistina o polimixine, senza lasciare scelte per il team sanitario nel trattamento delle infezioni gravi associate a MDR P. Aeruginosa.4

Recentemente, l’emergere di resistenza alle polimixine è stato osservato tra alcune specie di enterobacteriaceae come K. pneumoniae, E. coli, Enterobacter aerogenes e Enterobacter cloacae a causa del suo ampio uso per controllare le infezioni in medicina veterinaria. La resistenza alla colistina è diventata una sfida importante per il trattamento di infezioni potenzialmente letali, specialmente con la coesistenza di geni mcr-1 con altri geni di resistenza ai farmaci multipli come ESBL, MBL, geni NDM con la possibilità di emergere di resistenza ai farmaci pan.5,6

La colistina, nota come polimixina E, è un membro di una famiglia di polipeptidi cationici noti come polimixine. Questa famiglia di antibiotici è caratterizzata dalla presenza di una catena laterale acilica grassa lipofila. Al giorno d’oggi, la colistina viene reintrodotta nella terapia medica e considerata l’ultima risorsa per il trattamento di infezioni gravi causate da macchie MDR e XDR. In generale, l’azione delle polimixine sui batteri dipende principalmente dall’interazione elettrostatica tra l’antibiotico caricato positivamente e il gruppo fosfato caricato negativamente del lipide A localizzato sulla membrana esterna dopo il suo legame, si diffonde attraverso la membrana esterna, lo spazio periplasmico e interagisce con la membrana interna. Le polimixine causano destabilizzazione alla membrana esterna, formazione di pori, aumento della permeabilità, perdita di contenuto citoplasmatico seguita da lisi cellulare.7

La resistenza alla colistina si verifica principalmente a causa della modificazione chimica mediante l’aggiunta enzimatica di fosfoetanolammina al gruppo 4 phosphate – fosfato del lipide Una parte del lipopolisaccaride diminuendo la carica netta negativa della membrana esterna con conseguente diminuzione dell’affinità della polimixina. La resistenza alla colistina può essere il risultato di una mutazione codificata cromosomicamente come riportato in K. pneumoniae o del trasferimento orizzontale della resistenza mediante il gene resistente alla colistina (mcr-1) che trasporta plasmidi.8-11

L’emergere della resistenza alla colistina in vari paesi in Asia, Europa e alcuni paesi in Africa è diventata una delle preoccupazioni globali. Come, la diffusione della resistenza alla colistina indica la sua capacità di trasferire orizzontalmente da plasmidi coniugativi o verticalmente da mutazione cromosomica.12,13 Inoltre, essendo colistina una delle ultime linee di trattamenti per infezioni gravi, rendendo l’emergere di colistina resistenza isolati minacciando il mondo dalla comparsa di malattie infettive incurabili.14 Rilevamento della resistenza alla colistina in Egitto, che è un paese noto per il suo elevato carico di malattie infettive e la presenza di restrizioni basse o nulle sull’uso antimicrobico sia in veterinaria che in medicina, indicando l’emergere di malattie non trattabili nella nostra zona a causa della possibilità di trasferire la resistenza alla colistina a batteri altamente resistenti.15

In questo studio, studiamo la prevalenza della resistenza alla colistina tra MDR e XDR P. aeruginosa isolata da pazienti affetti da una varietà di infezioni nell’unità di terapia intensiva (ICU) dell’ospedale universitario di Minia in Egitto.

Materiali e metodi

Raccolta di isolati

Centosettantacinque campioni clinici di diverse fonti di infezioni sono stati raccolti da pazienti ricoverati in terapia intensiva nel Minia University Hospital, Minia, Egitto come parte delle procedure di routine ospedaliere-laboratorio. Tutti i campioni clinici sono stati coltivati su tripticasi soy agar (Lab M, UK) a 37°C e 42°C per 24 ore. Una colonia è stata sub-coltivata su piastre di agar MacConkey e agar cetrimide. Le colonie isolate sono state ulteriormente identificate in base alla morfologia delle colonie, alla fermentazione del lattosio, alle reazioni biochimiche (tra cui motilità solfuro–indolo, catalasi, ferro triplo zucchero, ureasi e ossidasi), alla capacità di crescere sull’agar cetrimide e di crescere a 42°C. 16 P. le colonie di aeruginosa sono state purificate mediante striature e le colonie pure sono state conservate a 4°C.

Test di sensibilità agli antibiotici

Sensibilità agli antibiotici con il metodo di diffusione del disco Kirby-Bauer

La sensibilità agli antibiotici contro diverse classi di antibiotici è stata testata con il metodo di diffusione del disco Kirby-Bauer.17 dischi Antibiotici utilizzati sono stati amoxicillina/clavulanico (AMC) (20/10 µg), ampicillina/sulbactam (SAM) (20 µg), meropenem (MEM) (10 µg), imipenem (IPM) (10 µg), cefepime (FEBBRAIO) (30 µg), cefoperazone (CEP) (75 µg), polimixina B (PB) (300 µg), ciprofloxacina (CIP) (5 µg), levofloxacina (BULGARO) (5 µg), gentamicina (CN) (10 µg), ceftazidime (CAZ) (30 µg), la tigeciclina (TGC) (15 µg), amikacina (AK) (30 µg), tobramicina (CF) (10 µg), aztreonam (ATM) (30 µg), piperacillina (PRL) (30 µg), carbenicillina (AUTO) (100 µg) (Oxoid; Basingstoke, UK). Gli isolati sono stati classificati come sensibili, intermedi e resistenti secondo gli standard di interpretazione delle zone di inibizione del Clinical Laboratory standards Institute (CLSI) 2018.18

MIC Determinazione dell’antibiotico colistina

Il metodo di diluizione dell’agar su Muller-Hinton agar è stato utilizzato per determinare la concentrazione inibitoria minima della colistina.19 Resistenza alla colistina è stata presa in considerazione se la MIC è ≥4µg / mL secondo le linee guida standard di CLSI.18

In base ai risultati della suscettibilità agli antibiotici, gli isolati sono stati classificati in MDR, XDR e PDR secondo i criteri precedentemente riportati.20

Combined Disc Diffusion Test (CDT)

Tutti gli isolati resistenti alla colistina (MIC ≥4) sono stati testati utilizzando EDTA da 100 mm (Sigma-Aldrich; St. 268 Louis, MO, USA) per inibire l’attività mcr-1 poiché questa concentrazione non ha mostrato attività antimicrobica. I ceppi batterici sono stati coltivati su Muller-Hinton agar (Lab M, UK) su cui sono stati utilizzati tre dischi. Un disco è stato saturato con 10 µL di 100 mm di EDTA per assicurare che la concentrazione di EDTA utilizzata non inibisca la crescita batterica. Gli altri due dischi erano 10µg colistina disco e 10 µg colistina più 10 µL 100 mm EDTA disco. Gli isolati sono stati osservati per un aumento ≥3mm del diametro della zona di inibizione del disco colistina/EDTA rispetto al disco colistina.21

Alterazione del potenziale Zeta

I geni mcr codificano fosfoetanolammina transferasi enzimi che attaccano enzimaticamente una frazione fosfoetanolammina (PEtN) al lipido A della membrana esterna dei batteri Gram-negativi che porta alla riduzione della sua carica negativa netta conferendo la resistenza alla colistina.22

Le cellule batteriche sono state lasciate crescere in presenza e assenza di EDTA 80 µg/mL. Quindi, la sospensione batterica è stata centrifugata a 5000 giri / min per 5 min a 5°C, quindi i pellet sono stati lavati due volte, dopo che i pellet sono stati sospesi in 2 mL di soluzione sterile 1 mm di NaCl regolata a 0,5 McFarland torbidità della soluzione standard. I campioni sono stati diluiti a 1:4 usando NaCl da 1 mm. Il potenziale Zeta è stato determinato in 2 ml del campione diluito. Le alterazioni del potenziale Zeta indotte da EDTA sono state calcolate dal rapporto potenziale Zeta (RZP=ZP+EDTA/ZP-EDTA), dove ZP+EDTA e ZP-EDTA corrispondono ai valori potenziali Zeta ottenuti per sospensioni batteriche coltivate in presenza o assenza di EDTA 80µg/mL, rispettivamente. RZP ≥ 2,5 valore considerato come criterio per l’identificazione di ceppi mcr-1 positivi.21

Estrazione del DNA

Il modello di DNA è stato estratto da una coltura notturna di P. aeruginosa come descritto in precedenza.23 Una sospensione di pellet batterico è stata bollita per 10 min, quindi centrifugata. Il surnatante è stato utilizzato direttamente nel test PCR.

Analisi PCR dei geni testati

L’esotossina A è un importante fattore di virulenza (un agente citotossico) di P. aeruginosa nelle infezioni cliniche. Questo fattore inibisce la biosintesi delle proteine che porta a grandi danni ai tessuti e agli organi. Il gene toxA, una sequenza genetica intrinseca situata sul cromosoma P. aeruginosa, viene utilizzato per la conferma di P. aeruginosa mediante PCR.

La PCR è stata eseguita in un volume totale di 25 µL contenente 1X tampone PCR, 1 µmol/L di ciascun primer, 1 µL di DNA genomico (circa 150 ng), 200 µmol/L di miscela dNTPs, 2 mmol/L di MgCl2 e 0,05 U/µL Taq DNA polimerasi. Sono state eseguite amplificazioni PCR per toxA FW:CTGCGGGGTCTATGTGCC, RV:GATGGGGGGGTCGAG in un termociclatore automatico (Eppendorf, Amburgo, Germania) nelle seguenti condizioni: 30 cicli di 1 min a 94°C, 1,5 min a 63°C e 1 min a 72°C. 24

I geni mcr-1 e mcr-2 sono stati analizzati mediante tecnica PCR convenzionale utilizzando i seguenti primer: mcr-1 FW (5′-AGTCCGTTTGTTGTTGTGC-3′), RV (5′-AGATCCTTGTCTCGGCTTG-3′) e mcr-2 Fw (5 AT-ATGACATCACATCACTCTTGG-3)), Rv (5 T-TTACTGGATAAATGCCGCGC-3ʹ).25,26 Le condizioni tecniche erano 34 cicli di 95 ° C per 1 min, 58°C per mcr-1 e 52°C per 30s, 72°C per 1min seguito da un’estensione finale di 72 ° C per 5 min.

Determinazione dell’inibizione delle pompe di efflusso mediante riduzione MIC mediante inibitore della pompa di efflusso (CCCP)

Il metodo di diluizione agar è stato utilizzato per la determinazione delle MIC utilizzando il brodo Mueller-Hinton regolato dai cationi (Sigma-Aldrich, St Louis, USA). I microfoni di CCCP (EPI) e colistina sono stati determinati per gli isolati testati. La sub-MIC di CCCP è stata utilizzata per determinare il suo effetto sulla colistina MIC; la concentrazione di CCCP (0,5× MIC) è stata costantemente mantenuta alle concentrazioni di MIC sopra indicate, mentre quella dell’antibiotico è stata aumentata in serie. I MIC degli isolati a colistina in assenza e presenza di CCCP sono stati determinati utilizzando un sub-MIC di CCCP (concentrazione finale di 10 mg/L) come già descritto.27 Le variazioni di MIC fold risultanti dopo l’aggiunta di CCCP sono state calcolate come rapporto tra il livello di MIC dell’antibiotico senza CCCP e quello dell’antibiotico aggiunto CCCP. Come precedentemente descritto da Osei Sekyere, Amoako28 che ha riferito che il criterio positivo per la presenza di pompe di efflusso negli isolati era una diminuzione ≥8 volte della colistina MIC dopo l’aggiunta di CCCP.

Pattern proteico della membrana esterna

Una singola colonia degli isolati testati di P. aeruginosa è stata coltivata in 5 ml di brodo LB a 37°C per 2 giorni con agitazione a 200 giri / min. Le celle sono state centrifugate a 8000 giri / min per 5 minuti. I pellet batterici sono stati sospesi in 1 ml di tampone di lisi (0,05 M Tris HCL, 2% SDS, 10% glicerolo), riscaldati a 95°C per 10 minuti. Quindi, i campioni sono stati centrifugati per 10.000 rpm per 30 min. Circa 50 µL di proteina estratta sono stati miscelati con tampone campione (4 ml di acqua deionizzata, 1 mL di 0,5 M Tris HCL, 1,6 ml 10% SDS, 0,4 ml 2-mercaptoetanolo, 0,2 ml di 1% (p/v) bromofenolo blu) (1:1) e separati da 12% di sodio dodecil solfato-poliacrilammide gel (SDS-PAGE).29

Lipopolisaccaride SDS-Poliacrilammide Gel Profile for Colistin Sensitive and Colistin-Resistant Isolates

LPS of the tested isolates were extracted and purified by hot aqueous-phenol method using Westphal, Jann30 and analyzed the purified material using SDS-PAGE, followed by carboidrato-specific silver staining.31

Risultati

Isolamento di Pseudomonas aeruginosa e suscettibilità agli antibiotici

Su 175 campioni raccolti da pazienti affetti da infezioni diverse, 75 campioni (42,8%) sono risultati positivi fenotipicamente per P. aeruginosa e positivo al gene toxA.

I test di suscettibilità antimicrobica hanno rivelato che il P. aeruginosa isolato era completamente resistente all’amoxicillina/acido clavulanico e un’elevata resistenza è stata osservata contro ampicillina/sulbactam (68%), ceftazidima (63%) e azetreonam (60%). Resistenza moderata è stata osservata sia contro tobramicina che contro tigeciclina (50% ciascuna). Inoltre, è stata dimostrata una bassa resistenza nei confronti di imipenem (6%) e meropenem (5,3%) (Figura 1). Secondo i risultati di sensibilità agli antibiotici, gli isolati resistenti sono stati classificati come MDR (96%), XDR (87%) e nessun isolato è stato classificato come PDR. Inoltre, è stato riscontrato che su 75 isolati, 16 isolati (21,3%) hanno mostrato resistenza all’antibiotico colistina con MIC ≥ 4µg/mL (da 8 a 256 µg/mL).

Figura 1 modello di resistenza agli antibiotici di tutti gli isolati isolati di P. aeruginosa.

Determinazione del Mcr-1 e Beta-2 Geni

Mcr-1 gene è stato rilevato fenotipicamente in colistina-resistenti isolati da conto alla ROVESCIA, dove le differenze tra i diametri delle Zone di inibizione colistina/EDTA e colistina dischi sono stati misurati per essere ≥ 3mm. I risultati hanno mostrato che il 6 isolati (37.5%) hanno mostrato un aumento del diametro della colistina/EDTA disco da 3 a 10 mm rispetto alla colistina disco da solo (Figura 2).

Figura 2 Rilevamento fenotipico per isolati positivi mcr mediante test di diffusione del disco combinato (CDT). (A): il ceppo positivo mcr-1 ha mostrato un aumento del diametro della zona dei dischi con colistina ed EDTA ≥ 3mm rispetto alla sola colistina. (B): l’isolato negativo mcr-1 ha mostrato una leggera variazione (1 mm) del diametro della zona di inibizione della colistina e del disco EDTA rispetto alla colistina da sola.

Alterazione del potenziale Zeta

D’altra parte, l’alterazione del test del potenziale Zeta è stata considerata come un rilevamento fenotipico ai geni MCR, ma i risultati non hanno mostrato cambiamenti significativi nel potenziale zeta tranne che in 2 isolati.

Rilevamento di geni di resistenza

Il rilevamento genetico di geni mcr utilizzando la tecnica PCR convenzionale ha rivelato che 8 (50%) isolati erano positivi per mcr-1, 6 di loro erano positivi per CDT, mentre 100% (16 isolati) erano negativi per mcr-2.

sensibilità agli Antibiotici di Colistina-Resistenti Isolati

La suscettibilità di colistina-resistente isolare contro altri antibiotici è stata determinata da Kirby-Bauer disco-diffusione del metodo, i risultati hanno dimostrato che il 100% degli isolati erano resistenti a Amoxicillina/clavulanico, mentre la resistenza all’Ampicillina/sulbactam, Cefepime e Tobramicina è stato 78.12%, 71.87% e 68.75% rispettivamente. I farmaci più efficaci erano meropenem, imipenem e ciprofloxacina (Figura 3)

Figura 3 modello di resistenza agli antibiotici di isolati resistenti alla colistina.

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Determinazione dell’inibizione delle pompe di efflusso mediante riduzione MIC Utilizzando CCCP

Studiando l’effetto di 0,5 MIC di CCCP sulla colistina MIC, è stato riscontrato che solo 3/16 isolati (P6, P8 & P16) (18,75%) hanno mostrato una riduzione dei MIC di colistina ≥ 8 volte (Tabella 1) in presenza di CCCP. Dai risultati precedenti, l’isolato no. 16 è stato trovato per avere meccanismo di efflusso e gene mcr-1.

Tabella 1 Colistina-Resistenti Isolati, Alcuni Possibili Meccanismi di Resistenza alla Colistina e la Loro Suscettibilità ad Altri Antibiotici

Membrana Esterna SDS-PAGE Profilo

Tabella 2 e Figura 4 mostra che, a cinque bande con peso molecolare di 66.7, 56.06, 47.8, 40.18 e 23.6 kDa erano stabili in isolati sensibili e resistenti, mentre una banda con un peso molecolare di 21 kDa è stata trovata solo in ceppi resistenti alla colistina che erano P1 (mcr-1 positivo) e P12 (mcr-1 negativo).

Tabella 2 Pesi Molecolari e Quantità % di Estratto Proteine della Membrana Esterna di Colistina Resistente e Colistina Sensibili P. Aeruginosa

Figura 4 membrana Esterna SDS-PAGE di colistina resistente e ceppi sensibili. Corsia 1: Marcatore proteico, Corsia 2 e Corsia 3: ceppi resistenti alla colistina (P1 & P12), Corsie 4-6: ceppi sensibili alla colistina.

Lipopolisaccaride (LPS) SDS-PAGE

Lipopolisaccaride tinto argento SDS-PAGE ha mostrato che colistina-resistente mcr-1 negativi isolati (P3, P6 e P10) non ha mostrato alcuna LPS bande modello (O-antigene ripetizioni o LPS core) che ha rivelato la possibilità della loro perdita e la resistenza di questi isolati di colistina. D’altra parte, il ceppo positivo mcr-1 resistente alla colistina ha mostrato ripetizioni di O-antigene (Figura 5, Corsia 5) che differisce dal modello di ripetizioni di O-antigene del ceppo sensibile alla colistina (Figura 5, Corsia 4) mentre entrambi hanno mostrato il nucleo LPS. Questi risultati possono indicare la presenza di LPS modificati nel ceppo positivo mcr-1.

Figura 5 bande LPS modello. Corsie 1, 2 & 3: ceppi negativi mcr-1 resistenti alla colistina (P3, P6 & P10, rispettivamente), Corsia 4: ceppi sensibili alla colistina e Corsia 5: ceppo positivo mcr-1 resistenti alla colistina (P1). Le ripetizioni dell’O-antigene sono inscatolate e la freccia si riferisce al centro di LPS.

Discussione

Recentemente, i ceppi batterici patogeni multiresistenti compaiono dove la maggior parte degli antibiotici disponibili non sono efficaci contro di loro.6,32-36 Le polimixine considerato l’ultima risorsa per il trattamento di infezioni batteriche multi-farmaco resistente, in modo da studiare l’emergere di colistina-resistente era un must. Le polimixine hanno mostrato la loro attività attraverso la loro interazione elettrostatica tra loro e le parti caricate negativamente sul lipido A dei batteri Gram-negativi con conseguente destabilizzazione della membrana esterna e perdita del contenuto citoplasmatico e della lisi.37,38

Si è scoperto che la causa più comune di resistenza alla polimixina è la modifica LPS mediante aggiunta di 4-ammino – 4-deossi-L-arabinosio (Lara4N) e fosfoetanolammina (codificata da geni di tipo mcr) o galattosammina al lipido A del nucleo LPS. Di conseguenza, una diminuzione della carica netta negativa dei residui di fosfato influenza l’affinità della polimixina alla membrana o dovuta all’effetto dei sistemi regolatori bicomponenti (TCSs) pmrA/pmrB e phoP/phoQ.39

Nel nostro studio, abbiamo rilevato la resistenza alla colistina in base ai risultati dei MIC seguiti dal loro test per la presenza di mcr-1 fosfoetanolammina transferasi utilizzando metodi fenotipici e il rilevamento di mcr-1gene. I metodi fenotipici dipendono da quel mcr-1 phosphoethanolamine è metalloproteina dello zinco. Quindi, qualsiasi diminuzione dello zinco diminuirà i MICROFONI di colistina negli isolati positivi per mcr-1. Essendo l’enzima codificante mcr-1, una metalloproteina di zinco consente di utilizzare EDTA come chelante metallico per ridurre lo zinco nei media e influenzare i MIC della colistina e i potenziali zeta degli isolati positivi mcr-1.40

Il nostro studio ha mostrato un’alta prevalenza di P. aeruginosa (42,8%). MDR P. aeruginosa corrispondeva al 96% degli isolati totali e l ‘ 87% era XDR. Alta prevalenza di P. aeruginosa resistente alla colistina (21.3%) è stato rilevato che può essere il risultato di misure di controllo delle infezioni insufficienti e l’uso improprio di antibiotici battericidi nelle unità di terapia intensiva dei nostri ospedali del paese. Inoltre, la colistina è ampiamente utilizzata nei nostri paesi nella promozione della crescita di animali da produzione alimentare, specialmente nell’industria del pollame mentre i carbapenemi sono utilizzati in casi di emergenza.15 Quindi, i carbapenemi hanno mostrato attività osservabile contro gli organismi testati rispetto alla colistina. D’altra parte, i nostri risultati sono stati osservati superiori a quelli riportati da Liassine et al25 che hanno riferito che un isolato di 300 isolati di diverse specie batteriche è stato identificato come P aeruginosa mostrando resistenza alla colistina e ospitando il gene mcr-1.

Combined disc diffusion test (CDT) e l’alterazione del potenziale zeta indotto da EDTA sono stati utilizzati come metodi fenotipici41,42 per la rilevazione del gene mcr-1. I risultati hanno mostrato che nessun isolato era positivo per mcr-2 e 8 (50%) isolati di isolati resistenti alla colistina erano mcr-1 positivi mentre 2 isolati di questi isolati hanno mostrato RZP > 2.5. Su 8 isolati mcr-1 positivi, 6 isolati erano positivi per CDT mentre due mcr-1 positivi (ceppo n. P15 e P16) sono risultati negativi per la CDT, che può essere dovuta alla co-produzione di un ulteriore meccanismo di resistenza alla colistina che interferisce con l’effetto dell’EDTA.21 Come, si è constatato che isolare no. P16 (mcr-1 positivo e CDT negativo) era positivo per efflusso.21,43-45 Inoltre, gli isolati resistenti alla colistina che erano negativi per mcr-1 possono avere mutazioni dovute all’uso a lungo termine di antimicrobici.

Inoltre, abbiamo testato isolati resistenti alla colistina per la presenza di meccanismi di efflusso utilizzando CCCP (un inibitore della pompa di efflusso) e la differenza di proteina di membrana esterna e profilo LPS SDS-PAGE tra isolati sensibili e resistenti. I nostri risultati hanno rivelato la presenza del meccanismo di efflusso tra 3 isolati mentre uno di loro era mcr-1 positivo. Il profilo proteico della membrana esterna ha mostrato una banda con un peso molecolare di 21 kDa negli isolati resistenti P1 (mcr-1 positivo) e P12 (mcr-1 negativo resistente alla colistina). Inoltre, è stato riscontrato che i ceppi negativi mcr-1 resistenti alla colistina non mostravano un pattern di bande LPS (ripetizioni O-antigene o nucleo LPS) ma gli isolati sensibili mcr-1 positivi (P1) e colistina mostravano un pattern di ripetizioni O-antigene diverso. Machado et al20 hanno studiato il ruolo della pompa di efflusso nella resistenza alla colistina in Acinetobacter baumanni e hanno scoperto che l’attività di efflusso contribuisce all’eteroresistenza di A. baumanni in assenza di mutazione. Marjani et al43 hanno mostrato che il 22,5% della P. aeruginosa isolata era resistente alla colistina, che è vicina ai nostri risultati e più del 50% degli isolati resistenti alla colistina erano positivi per le pompe di efflusso.

Sebbene l’esatto meccanismo di uccisione batterica da parte della colistina o delle polimixine non sia chiaramente noto, è noto che il loro legame con i peptidi caricati positivamente e il lipide A caricato negativamente è un passo critico. Quindi, abbiamo testato il loro profilo LPS SDS-PAGE e una differenza significativa tra i ceppi testati è stata osservata. In uno studio condotto da Moffatt et al,46 è stato riportato che la perdita di LPS ha provocato l’emergere di A. baumanii resistente alla colistina che si verifica a causa dell’inattivazione dei geni della biosintesi lipidica A (lpxA, lpxC o lpxD). Proteina della membrana esterna dei modelli ha mostrato la presenza di una banda di peso molecolare, che è di 21 KDa in colistina-resistenti isolati che possono corrispondere a OprH secondo quanto riportato dal Nicas e Hancock47 che hanno riferito che OprH espressione svolge un ruolo nella resistenza di Pseudomonas alla polimixina e EDTA perché OprH sostituisce cationi divalenti nella membrana esterna con conseguente blocco dei polycationic antibiotico assorbimento. La scoperta precedente può spiegare perché ceppo no. P1 (mcr-1 positivo) era negativo per CDT.

Conclusioni

Il presente studio ha mostrato un’alta prevalenza di MDR e XDR P. aeruginosa che mostrano resistenza alla colistina tra i pazienti ricoverati in terapia intensiva affetti da diverse infezioni. Inoltre, ha mostrato la presenza di diversi meccanismi che possono causare resistenza alla colistina. Ciò indica l’urgente necessità di cambiare le strategie di trattamento antibiotico sia per gli esseri umani che per gli animali.