Prospect of Stem Cell Conditioned Medium in Regenerative Medicine

Abstract

Background. Il mezzo condizionato derivato dalle cellule staminali ha una prospettiva promettente da produrre come prodotti farmaceutici per la medicina rigenerativa. Obiettivo. Studiare vari metodi per ottenere un mezzo condizionato derivato dalle cellule staminali (CM) per ottenere una panoramica della loro prospettiva di applicazione in varie malattie. Metodo. Revisione sistematica utilizzando le parole chiave “cellule staminali” e “mezzo condizionato” o “secretome” e ” terapia.”Sono stati notati, raggruppati, tabulati e analizzati i dati relativi alle condizioni/malattie trattate, al tipo di cellula che è stata coltivata, al mezzo e agli integratori per la coltura delle cellule, alle condizioni di coltura, all’elaborazione CM, ai fattori di crescita e ad altre secrezioni che sono state analizzate, al metodo di applicazione e all’esito. Risultato. La maggior parte degli studi CM utilizzando ha mostrato buoni risultati. Tuttavia, i vari CM, anche quando erano derivati dallo stesso tipo di cellule, erano prodotti da condizioni diverse, cioè da diversi passaggi, mezzo di coltura e condizioni di coltura. I rendimenti del fattore di crescita dei vari tipi di cellule erano disponibili in alcuni studi e il numero di cellule necessario per produrre CM per un’applicazione poteva essere calcolato. Conclusione. Vari mezzi condizionati derivati dalle cellule staminali sono stati testati su varie malattie e per lo più hanno mostrato buoni risultati. Tuttavia, devono essere condotti metodi standardizzati di produzione e convalide del loro uso.

1. Introduzione

I dati sull’uso delle cellule staminali in varie malattie si stanno accumulando. Alcuni studi hanno riportato effetti benefici della terapia con cellule staminali nelle malattie degenerative come l’infarto miocardico e ha rivelato che le cellule staminali causare la riparazione dei tessuti a causa della loro capacità di secernere fattori trofici che esercitano un impatto positivo sul tessuto danneggiato, piuttosto che la loro capacità di differenziarsi nelle necessari cellule . Vari studi sui fattori secreti derivati dalle cellule staminali hanno dimostrato che il fattore secreto da solo senza la cellula staminale stessa può causare la riparazione dei tessuti in varie condizioni che hanno coinvolto danni ai tessuti/organi. I fattori secreti sono indicati come secretome, microvescicole o esosoma e possono essere trovati nel mezzo in cui le cellule staminali sono coltivate; quindi, il mezzo è chiamato mezzo condizionato (CM) .

L’uso di secretome contenente CM presenta diversi vantaggi rispetto all’uso di cellule staminali, poiché CM può essere fabbricato, liofilizzato, confezionato e trasportato più facilmente. Inoltre, poiché è privo di cellule; non è necessario abbinare il donatore e il ricevente per evitare problemi di rigetto. Pertanto, il mezzo condizionato derivato dalle cellule staminali ha una prospettiva promettente per essere prodotto come medicinale per la medicina rigenerativa.

Ad oggi, non è stato riportato alcun studio clinico che utilizzasse CM per una certa malattia, ad eccezione di due studi pilota sull’uso di CM di cellule staminali mesenchimali derivate adipose per la rigenerazione del follicolo pilifero e la guarigione delle ferite di riemersione di anidride carbonica frazionata nell’uomo, che hanno mostrato buoni risultati. L’uso della CM per la terapia è molto attraente e potrebbe essere in piena espansione nel prossimo futuro, poiché si stanno accumulando studi sull’uso della CM per varie malattie . Il mezzo condizionato contiene vari fattori di crescita e agenti rigenerativi tissutali, che sono stati secreti dalle cellule staminali. Il fatto che le cellule staminali secernano vari fattori di crescita è stato dimostrato anche da vari studi proteomici, che hanno rivelato la presenza di vari fattori di crescita e altre citochine nel CM .

Tuttavia, vari studi hanno riportato l’uso di vari tipi di cellule staminali e vari metodi per ottenere la CM per curare vari tipi di malattie degenerative in vari modelli animali. Pertanto, questa revisione sistematica mirava a indagare i vari metodi per ottenere la CM e le varie malattie che sono state trattate, per ottenere una panoramica dei vari tipi di CM e il loro beneficio di applicazione in varie malattie.

2. Materiali e Metodi

Abbiamo eseguito “tutto il testo” ricerche e senza limiti di tempo su gennaio 23, 2014, in Pubmed/Medline utilizzando le parole chiave “cellule staminali” e “condizionato” o “secretome” e “terapia”, “tutto il testo” cerca nella Cochrane library (prove) utilizzando le parole chiave “secretome” o “condizionato” e “tutto il testo” per la ricerca in ClinicalTrials.gov utilizzando le parole chiave “cellule staminali” e “condizionato” o “secretome” e “terapia.”Inoltre, sono stati aggiunti articoli pertinenti esistenti nella nostra biblioteca.

I criteri di inclusione sono tutti studi che hanno utilizzato la CM per una determinata malattia. I criteri di esclusione sono studi che non contenevano dati completi relativi al modello di condizione/malattia del soggetto, all’origine della CM e all’esito del trattamento con CM.

La raccolta dei dati è la seguente :condizioni/malattie trattate, tipo di cellula che è stata coltivata, composizione dettagliata del mezzo e integratori che sono stati utilizzati per la coltura delle cellule, condizione di coltura (ipossia o normossia) per ottenere il CM, l’elaborazione del CM, i fattori di crescita e altre secrezioni che sono state analizzate; metodo (modalità) di applicazione e

La sintesi dei dati è la seguente: i dati sono stati raggruppati in base alla malattia trattata e ai tipi di cellule utilizzati per produrre la CM. Inoltre, per conoscere i rendimenti del fattore di crescita dei vari tipi di cellule, quando disponibili, i livelli del fattore di crescita sono stati tabulati e raggruppati in base ai tipi di cellule che hanno prodotto il fattore di crescita contenente il mezzo condizionato, in relazione al numero di cellule, al tipo e alla durata della coltura e all’elaborazione del mezzo condizionato. Quando i dati erano disponibili, è stato calcolato il numero di celle necessarie per produrre il CM per un’applicazione.

3. Risultati e discussione

Abbiamo ottenuto 39 articoli che soddisfacevano i criteri di inclusione e 7 sono stati esclusi a causa di dati incompleti. Varie condizioni / malattie sono state trattate con vari CM derivati dalle cellule e per lo più hanno mostrato risultati promettenti (Tabella 1).

I vari mezzi condizionati, anche quando erano derivati dallo stesso tipo di cellule, erano prodotti da condizioni diverse, cioè da diversi passaggi, numero di cellule, mezzo di coltura e condizione di coltura (Tabella 2). I rendimenti del fattore di crescita dei vari tipi di cellule possono essere visti nella tabella 3 e il numero di cellule necessario per produrre CM per un’applicazione può essere visto nella Tabella 4.

Vari studi hanno dimostrato che il mezzo condizionato è stato testato in vari tipi di malattie / condizioni (Tabella 1), cioè alopecia , ischemia acuta e cronica degli arti posteriori , guarigione acuta e cronica delle ferite , infarto miocardico , lesione epatica acuta/insufficienza , lesione cerebrale/ischemia/ictus , lesione del midollo spinale , lesione polmonare e difetto osseo e ha mostrato un miglioramento delle condizioni. Inoltre, la malattia renale cronica che è stata trattata utilizzando cellule staminali mesenchimali derivate da cellule staminali embrionali umane (huESC-MSC) CM ha mostrato una diminuzione della pressione sanguigna sistolica e della proteinuria e un miglioramento del danno tubulare e glomerulare, del flusso sanguigno renale e della velocità di filtrazione glomerulare . Tuttavia, la nefropatia che è stata trattata utilizzando CM da cellule staminali somatiche senza restrizioni del sangue del cordone ombelicale umano (huUCB-USSC) o cellule staminali mesenchimali del midollo osseo di topo (mBM-MSC) CM non ha mostrato miglioramenti nel livello di urea e creatinina sierica, danno istopatologico e punteggio di attività fisica . Inoltre, la prevenzione del cancro utilizzando la linea di cellule staminali mesenchimali umane CM ha mostrato un aumento della proliferazione e della vascolarizzazione delle cellule tumorali .

Nei due casi di malattia renale, si può concludere che CM da hu-ESC-MSC può migliorare la condizione e il livello del fattore di crescita necessario è presumibilmente sufficiente poiché l’elaborazione CM include una fase di concentrazione di 25 volte . Tuttavia, per hu-UCB-USSC o mBM-MSC-CM, la mancanza di dati relativi all’elaborazione della CM e al livello del fattore di crescita della CM impedisce ulteriori analisi per concludere se il mancato miglioramento della condizione sia dovuto alla mancanza di determinati fattori di crescita o al livello dei fattori di crescita troppo basso per dare un effetto.

3.1. Terreno di coltura e supplemento

Alcuni studi hanno utilizzato siero bovino fetale o altro integratore contenente mezzo completo, mentre altri studi hanno utilizzato mezzi privi di siero. Inoltre, i supporti basali utilizzati erano variabili, ad esempio aMEM, DMEM, DMEM/F12, M199, EBM2, EGM-2, in vivo 15 o mezzo chimicamente definito, e lo stesso tipo di cellula potrebbe essere coltivato in diversi tipi di mezzo basale (Tabella 2). Il terreno di coltura in coltura in vitro rappresenta il microambiente in condizioni in vivo e può determinare il destino cellulare e quindi la secrezione cellulare . Pertanto, lo stesso tipo di cellule può secernere diversi livelli di fattori di crescita quando sono state coltivate in un mezzo diverso, come si può vedere nella Tabella 3 .

3.2. Durata della coltura

La produzione di CM varia nella durata della coltura da sedici ore a cinque giorni (Tabella 3). Nel caso in cui sia stato utilizzato un mezzo completo, una breve durata della coltura potrebbe lasciare determinati fattori di crescita derivati dal siero che non sono stati consumati dalle cellule e potrebbero aumentare il livello del fattore di crescita o, al contrario, sopprimere la secrezione del fattore di crescita da parte delle cellule. La possibilità della presenza di fattore di crescita residuo dal mezzo può essere vista in uno studio, che ha dimostrato che il mezzo senza cellula conteneva un livello TGF-b1 di pg / mL (Tabella 3) .

3.3. Condizioni di coltura

La maggior parte degli studi ha prodotto CM in colture monostrato, ma diversi studi hanno utilizzato colture sferoidi (Tabella 3). Le colture sferoidi hanno bisogno di una manipolazione e di attrezzature speciali (pallone filatore) ma producono più cellule rispetto alle colture monostrato convenzionali, e quindi più fattori secreti (Tabella 4). Inoltre, le cellule situate al centro dello sferoide possono essere in condizioni ipossiche relative rispetto alle cellule sulla superficie, aumentando così ulteriormente la resa del fattore di crescita.

3.4. Ruolo del fattore secreto nel miglioramento delle malattie

Varie citochine sono state secrete dalle cellule staminali nel CM e hanno svolto un ruolo nel miglioramento di varie malattie/condizioni. Queste citochine possono essere raggruppate in fattori di crescita, citochine proinfiammatorie e antinfiammatorie e altre citochine. Vari studi hanno utilizzato vari metodi per valutare varie citochine nella CM condizionata, dai saggi ELISA convenzionali ai metodi di profilazione proteomica .

3.4.1. Fattori di crescita

Inoltre, gli studi che hanno analizzato vari fattori di crescita hanno riportato la presenza dei vari fattori di crescita, che sono stati secreti da varie cellule staminali nel loro mezzo condizionato (Tabella 3), ad eccezione di MSC umano (Lonza) che non secerne FGF-2, PDGFBB, BMP-2 e SDF-1 ma secreto IGF-1, VEGF, TGF β1 e HGF . Inoltre, diverse condizioni di coltura e mezzo possono produrre diversi livelli di secrezioni del fattore di crescita .

3.4.2. Citochine pro-e anti-infiammatorie

3.4.3. Altre citochine

3.5. Traduzione del mezzo condizionato Utilizzo in pazienti

Nel mezzo condizionato, vari fattori possono essere presenti come cocktail e agire di concerto per promuovere la rigenerazione. Pertanto, è importante analizzare un set completo di livelli di fattore di crescita e citochine per ogni tipo di mezzo condizionato derivato dalle cellule staminali e conoscere le condizioni di coltura, l’elaborazione del mezzo condizionato e le malattie/condizioni che rispondono a un determinato trattamento del mezzo condizionato. Quando è noto il contenuto delle varie citochine in un determinato mezzo condizionato, è possibile determinare il risultato del mezzo condizionato su una determinata malattia/condizione e la strada per la traduzione in pazienti è aperta.

Da studi che hanno analizzato il livello di VEGF possiamo concludere che la maggior parte delle cellule staminali secernono VEGF. Poiché il VEGF svolge un ruolo sull’angiogenesi che è importante nella rigenerazione di tessuti/organi feriti/danneggiati, vari mezzi condizionati derivati dalle cellule staminali sono in grado di curare varie malattie e avranno un impatto maggiore sulle malattie con ischemia. Inoltre, VEGF può prevenire l’apoptosi in condizioni ipossiche, prevenendo così ulteriori danni .

Inoltre, FGF2 è un fattore angiogenico più potente rispetto al VEGF, con effetto aggiuntivo sulla proliferazione di fibroblasti, preadipociti e cellule staminali endoteliali, epiteliali e neurali, sulla migrazione delle cellule gliali e miogeniche derivate dalla cresta neurale e sulla differenziazione delle cellule neuroepiteliali in neuroni maturi e cellule gliali .

Altri fattori di crescita contribuiscono alla rigenerazione degli organi tessuti feriti / danneggiati, con particolare attenzione alla proliferazione, cioè PDGF per tessuto connettivo, gliale e altre cellule, EGF per cellule mesenchimali, gliali e epiteliali e IGF-I e IGF-II per vari tipi di cellule . Inoltre, PlGF che è un membro della famiglia VEGF aumenta l’attività del VEGF in vitro e in vivo , KGF inibisce lo stress ossidativo indotto cellule epiteliali morte , NGF promuove la crescita dei neuriti e la sopravvivenza delle cellule neurali , il BDNF è neuroprotettivo, promuove la sopravvivenza delle cellule e riduce astroglial formazione di cicatrice , e alcuni fattori di crescita, tra cui HEGF, FGF-7, EGF, e HGF promuovere la rigenerazione epatica .

Le citochine proinfiammatorie che svolgono un ruolo nella rigenerazione sono IL-1b a causa del suo ruolo protettivo del fegato , IL-8 a causa della sua attività angiogenica e IL-9 a causa dell’attività di promozione della guarigione delle ferite . Inoltre, le citochine antinfiammatorie prevengono l’infiammazione e promuovono la rigenerazione del fegato .

Il recettore MCSF (MCSFR) promuove la crescita e lo sviluppo del progenitore mieloide, del fagocita mononucleare e del trofoblasto placentare e il PDGFR può interagire con varie molecole di segnalazione o integrina per causare proliferazione cellulare, motilità , differenziazione o sopravvivenza mediante inibizione dell’apoptosi .

Inoltre, un fattore può contribuire a più di una modalità di azione rigenerativa, come MCP-1 che è coinvolto nell’angiogenesi e nell’attività di protezione del fegato . Inoltre, per la produzione di CM da applicare in varie malattie umane, i dati degli studi sugli animali che hanno mostrato risultati promettenti sono molto preziosi.

3.5.1. Produzione di CM per la traduzione in varie malattie umane

Per utilizzare CM per varie malattie umane, il metodo di produzione del CM deve essere standardizzato in termini di tipo e numero di cellule necessarie per produrre CM, terreno di coltura e condizione e lavorazione del mezzo condizionato. Inoltre, anche il volume e la modalità di consegna sono importanti. Poiché vari studi hanno utilizzato vari numeri e tipi di cellule e varie dosi di CM, è importante conoscere il numero di cellule che hanno prodotto il CM per un’applicazione, che può essere interpolata per gli studi sull’uomo. Pertanto, nella Tabella 4 abbiamo riassunto tutti i dati che potrebbero essere necessari per l’interpolazione in studi sull’uomo, cioè malattie che sono state trattate, specie ed età o peso corporeo dell’animale, tipo di cellula, terreno di coltura e condizione, numero di cellule da produrre CM per un’applicazione, volume e modalità di applicazione. Inoltre, varie possibili applicazioni di CM per varie condizioni sono riassunte nella Figura 1.

Figura 1

Varie possibili applicazioni di CM per varie condizioni.

Inoltre, per la traduzione in pazienti, è molto importante analizzare e annotare i vari contenuti di citochine dei vari media condizionati. Inoltre, per ogni mezzo condizionato con contenuto di citochine noto, deve essere condotta la convalida del suo uso su varie malattie. Infine, la possibilità di promozione del cancro esistente deve essere testata per ogni CM e si deve prestare attenzione prima della terapia con CM per garantire che il ricevente sia privo di cancro.

I vantaggi della produzione di vari CM per i pazienti risiedono nella possibilità di produzione di massa da parte delle aziende farmaceutiche, quando i metodi di produzione sono stati standardizzati. I media condizionati non sono come le cellule staminali che hanno bisogno di un impianto di buona pratica di fabbricazione (GMP) da applicare ai pazienti . Quando CM è stato confezionato correttamente, può essere trasportato facilmente come farmaci e non ha bisogno di crioconservazione, ad esempio che le cellule staminali hanno bisogno. Tuttavia, rispetto alle cellule staminali che possono sopravvivere per un periodo piuttosto lungo, la CM deve essere somministrata più frequentemente, poiché le emivite delle citochine e dei fattori di crescita sono per lo più più brevi , il che è uno svantaggio per i pazienti ma darà più profitto alle aziende farmaceutiche.

4. Conclusione

Vari mezzi condizionati derivati dalle cellule staminali sono stati prodotti con vari metodi e trattamenti e testati su varie malattie e per lo più hanno mostrato buoni risultati. Tuttavia, devono essere condotti metodi standardizzati per varie produzioni di media condizionati e convalide del loro uso su varie malattie.

Conflitto di interessi

L’autore dichiara che non vi è alcun conflitto di interessi per quanto riguarda la pubblicazione di questo documento.

Riconoscimento

Questo studio è stato finanziato dalla borsa di ricerca del Ministero indonesiano dell’Istruzione e della Cultura (Pusnas 2014), Contratto n. 2218/H2.R12 / HKP.05.00/2014.