Raffinazione phylum Chlorobi risolvendo la filogenesi e potenziale metabolico del rappresentante di uno profondamente ramificazione, incolto lignaggio

Genomica ricostruzione di NICIL-2
L’analisi filogenetica di NICIL-2
Metabolico ricostruzione di NICIL-2
Metabolismo del carbonio
Metabolismo dell’azoto e dello zolfo
Biosintesi degli amminoacidi
Electron transport
Flagelli e chemiotassi

Genomica ricostruzione di NICIL-2

comunità Microbica analisi della composizione termofili consorzi adattati a crescere a biomassa substrati (cellulosa, xylan e il panico verga) come loro unica fonte di carbonio a 60 °C costantemente identificato un onnipresente OTU97 che era lontanamente correlato ai membri colti del phylum Chlorobi (Eichorst et al., 2013, 2014). Il sequenziamento metagenomico di un consorzio adattato a crescere su switchgrass pretrattato ionico-liquido, in cui l’OTU97 correlato al Clorobi era abbondante, è stato eseguito per comprendere la filogenesi e il potenziale metabolico della popolazione rappresentata da questo OTU97. Assemblaggio (vedi Materiali e metodi) e binning automatizzato (Wu et al., 2014) del metagenoma di questo consorzio ha prodotto 20 contenitori genomici (Tabella supplementare S3), tra i quali i contenitori più abbondanti erano una popolazione strettamente correlata al ceppo Chitinophagaceae NYFB (61,8%), che è stato isolato da un arricchimento correlato coltivato su cellulosa (Eichorst et al., 2013), e il bin Chlorobi-correlati (23.1%). I bin presenti a > 1% includevano più popolazioni incolte raggruppate con le Paenibacillaceae (bins 003 e 006), una popolazione incolta raggruppata con Verrucomicrobia sottodivisione 3 (bin 004) e una popolazione strettamente correlata alla Thermobipora bispora (bin 005), un termofilo actinobatterico.

Il recipiente Chlorobi-related è stato nominato NICIL-2 (per Newby Island Compost Ionic Liquid-2nd in abbondanza). L’analisi delle proteine previste dal genoma di NICIL-2 è stata coerente con la sua identificazione come popolazione lontanamente correlata ai membri del superphylum FCB, con i Bacteroidetes (33%) e gli Ignavibatteri (15,7%) che hanno le sequenze proteiche più strettamente correlate (Figura 1). Il progetto di genoma NICIL-2 recuperato era relativamente piccolo (2,67 Mbps) e quasi completo (95,3%; 102 su 107 geni marcatori a singola copia in 152 scaffold). La lunghezza N50 per il progetto genoma NICIL-2 era 168 929 bp e il più grande contig era 1.1 MB, suggerendo che la maggior parte degli scaffold rappresentava un assemblaggio di alta qualità (Tabella 1).

Tabella 1 Caratteristiche genomiche di NICIL-2 bin

L’analisi filogenetica di NICIL-2

Un gene rRNA 16S (1451 bp) è stato recuperato dal genoma di progetto NICIL-2. Il ribotipo più strettamente correlato al gene 16S rRNA di NICIL-2 (>99% identico) è stato sequenziato da un clone fosmid (JFF029_06) recuperato da un flusso termico (70 °C) in una sequenza di miniera d’oro giapponese (Nunoura et al., 2005). I geni rRNA 16S provenienti da rappresentanti in coltura dei Bacteroidetes e dei Chlorobi erano <85% identici alla sequenza NICIL-2. Un albero filogenetico costruito allineando sequenze di geni rRNA 16S relative a NICIL-2 ha dimostrato che il lignaggio contenente NICIL-2 era distinto dai Bacteroidetes e dai Chlorobi (Figura 2). Il lignaggio NICIL-2 conteneva due linee di discesa in base alla temperatura dell’ambiente di campionamento. Il cluster ad alta temperatura (raffigurato in rosso nella figura 2) comprendeva ribotipi principalmente recuperati da ambienti ad alta temperatura che vanno da 55 °C a 80 °C, come il clone OPB56 (Hugenholtz et al., 1998). Il secondo cluster comprendeva ribotipi principalmente recuperati da ambienti a temperatura moderata che vanno da 20 ° C a 32 °C (raffigurati in verde nella Figura 2). Dal momento che OPB56 è stato il primo clone scoperto che è affiliato con questo cluster filogenetico, il lignaggio contenente NICIL-2 è indicato come il clade OPB56. Una vista estesa dell’albero del gene rRNA 16S è raffigurata nella figura supplementare S1.

Per stabilire più completamente l’affiliazione filogenetica di NICIL-2 e del clade OPB56, sono state ottenute sequenze proteiche ribosomiali aggiuntive da dati recuperati da campioni naturali. Omologhi di 22 geni ribosomiali conservati in NICIL-2 sono stati trovati in due cloni giapponesi di fosmidi a molla termica (JFF029_C06 e JFF027_B02). Questo set di 22 proteine ribosomiali è stato utilizzato per cercare set di dati metagenomici da ambienti ad alta temperatura. Set completi di questi geni ribosomiali conservati sono stati identificati in quattro set di dati metagenomici ottenuti da ambienti ad alta temperatura. Il binning automatizzato di questi set di dati ha recuperato sei genomi di bozza quasi completi (>90% completi) che contenevano sequenze per le 22 proteine ribosomiali conservate nel genoma NICIL-2 e nei cloni fosmid della miniera d’oro giapponese (Tabella supplementare S4). Cinque delle sei sequenze proteiche concatenate raggruppate con nel lignaggio OPB56 con NICIL-2, mentre una delle sequenze di Yellowstone Fairy Falls raggruppata con gli Ignavibatteri (Figura 3a). Questo albero filogenetico ha dimostrato che il Chlorobea, Ignavibacteria e OPB56 formavano un clade monofiletico con alta confidenza (97%). I Bacteroidetes formavano un cluster distinto e la famiglia Rhodothermaceae, la cui affiliazione con i Bacteroidetes è stata messa in discussione (Nolan et al., 2009), sono stati affiliati con i Bacteroidetes con alta fiducia (>80%). Un secondo albero filogenetico è stato costruito concatenando un allineamento di 86 geni a copia singola condivisi tra Bacteroidetes, Chlorobi e Fibrobacter (Figura 3b). Questo albero riproduceva la topologia osservata per il gene costruito dai 22 geni ribosomiali, sostenendo ulteriormente l’affiliazione dei Clorobea, degli Ignavibatteri e dell’OPB56.

Un approccio complementare alla comprensione delle relazioni evolutive tra batteriodeti e Clorobi è stato quello di identificare gli indelli nelle proteine conservate (Gupta e Lorenzini, 2007). Le inserzioni nella DNA polimerasi III (28 aa) e nella alanil-tRNA sintetasi (12-14 aa) che sono conservate tra i GSB e assenti tra i batteriodeti sono state attribuite come caratteristiche del phylum Chlorobi. Allineamenti di queste due proteine (Figure supplementari S2 e S3) indicano che l’inserimento della DNA polimerasi III nelle sequenze proteiche GSB non è presente nelle proteine previste dai genomi Ignavibacteriae e NICIL-2, mentre 2-3 amminoacidi dell’inserimento nelle sequenze di alanil-tRNA sintetasi GSB sono conservati nelle sequenze proteiche Ignavibacteria e NICIL-2.

Metabolico ricostruzione di NICIL-2

La fisiologia del NICIL-2, è stata dedotta da metabolico ricostruzione e il suo potenziale metabolico rispetto ai rappresentanti del GBS (Chlorobaculum tepidum), Bacteroidetes (Rhodothermus marinus e Salinbacter ruber) e Ignavibacteria (Ignavibacterium album e Meliobacter roseus). Geni che codificano proteine correlate alla fotosintesi, compresi gli omologhi di C. le subunità fotosintetiche del centro di reazione di tepidum (CT1020, pscB, psC, pscD), le proteine dell’involucro del clorosoma (csmABCDEFHIJX) e le proteine della batterioclorofilla a (fmoA), sono assenti in tutti gli altri genomi, distinguendo il GSB in questo insieme comparativo (Eisen et al., 2002). Una sintesi visiva della ricostruzione metabolica è presentata in Figura 4. Per informazioni complete sui geni, numeri di casella e abbreviazioni, vedere Tabelle supplementari S5 e S6.

Metabolismo del carbonio

Il genoma NICIL-2 codifica un set completo di geni per la glicolisi, il ciclo TCA e la gluconeogenesi (Figura 4). I geni per il ciclo rTCA, che sono presenti ed espressi per la fissazione autotrofica del carbonio nel GSB, sono assenti. Inoltre, la presenza di geni che codificano cofattori contenenti acido lipoico nei complessi piruvato deidrogenasi e α-chetoglutarato deidrogenasi suggerisce che il ciclo TCA funzioni in direzione ossidativa. La maggior parte del ciclo rTCA è stato ricostruito in R. marinus e I. album, comprendente più piruvato-ferredossina ossidoreduttasi e α-chetoglutarato-ferredossina ossidoreduttasi, due enzimi necessari per il ciclo rTCA. I genomi I. album e R. marinus mancano di citrato liasi ATP-dipendente, un enzima critico per completare il ciclo rTCA (Buchanan e Arnon, 1990). È stato proposto che I. album possa utilizzare una liasi citrata indipendente dall’ATP per funzionare nel ciclo rTCA, anche se questa affermazione non è testata sperimentalmente e né I. album né R. marinus hanno dimostrato di crescere autotroficamente (Liu et al., 2012a).

Nonostante la sua elevata abbondanza relativa in colture adattate che crescono su biomassa vegetale, NICIL-2 aveva una capacità enzimatica sorprendentemente limitata di decostruire biomassa complessa. Il confronto del potenziale metabolico per l’idrolisi dei polisaccaridi tra i 20 bidoni estratti dal metagenoma dall’arricchimento pretrattato-switchgrass ha dimostrato che NICIL-2 ha relativamente meno geni per la decostruzione della cellulosa e dell’emicellulosa rispetto ad altri membri della comunità microbica (Figura supplementare S4). In particolare, il ceppo NYFB, la popolazione verrucomicrobica e più Firmicuti Gram-positivi hanno repertori più estesi di geni per l’idrolisi dei polisaccaridi. Un’ulteriore ispezione dei genomi affiliati all’OPB56 ricostruiti da campioni naturali ad alta temperatura ha dimostrato che la mancanza di geni per l’idrolisi dei polisaccaridi era comune a questo clade. Tra i genomi clustering con i Bacteroidetes e Chlorobi, R. marinus, M. roseus e Yellowstone Obsidian Pool Bin 062, che si raggruppano con gli Ignavibatteri, possedevano un vasto repertorio di idrolasi glicosidiche per decostruire la biomassa vegetale. Queste analisi suggeriscono che NICIL-2 e membri correlati del clade OPB56 probabilmente non sono coinvolti nella decostruzione primaria della biomassa nella comunità adattata e negli ambienti naturali. È concepibile che NICIL-2 possa svilupparsi sui monomeri o sugli oligomeri dello zucchero; tuttavia, soltanto un gene predetto del trasportatore del disaccaride è stato identificato nel genoma.

Sebbene la selezione per NICIL-2 sia avvenuta in condizioni aerobiche, può possedere la capacità di fermentazione. Sono presenti geni per la produzione fermentativa di etanolo (tramite alcol deidrogenasi, EC 1.1.1.1), mentre sono assenti geni per formiato (tramite piruvato formiato liasi, EC 2.3.1.54), lattato (via lattato deidrogenasi, EC 1.1.1.27) e propionato (via metilmalonil-CoA carbossil transferasi, 2.1.3.1). Il genoma NICIL-2 codifica un gene per la fosfotransacetilasi (EC 2.3.1.8), ma non la chinasi dell’acetato (EC 2.7.2.1), entrambi necessari per la produzione di acetato fermentativo. Sia I. album che M. roseus contengono geni per la produzione di lattato e acetato, mentre C. tepidum no.

Metabolismo dell’azoto e dello zolfo

I geni per l’assimilazione dell’ammonio, la glutammina sintasi (EC 6.3.1.2) e la glutammato sintasi (EC 1.4.1.13) sono stati rilevati nel genoma NICIL-2. Tuttavia, non sono stati identificati geni per la riduzione dissimilatoria dei nitrati, la riduzione assimilatoria dei nitrati, la denitrificazione, la fissazione dell’azoto e la nitrificazione. C. tepidum codifica i geni nif necessari per la fissazione di N2, mentre M. roseus (Kadnikov et al., 2013), I. album (Liu et al., 2012a) e R. marinus (Nolan et al., 2009) non. C. tepidum è un ossidante di zolfo obbligato e quindi può ossidare solfuro, tiosolfato, solfito e zolfo elementare. C. tepidum ossida preferenzialmente il solfuro in zolfo elementare, quindi zolfo elementare e tiosolfato in solfato (Chan et al., 2008). Inoltre, il solfito può essere ossidato quando viene fornito nel mezzo di crescita, ma non può sostenere C. tepidum come unico donatore di elettroni (Rodriguez et al., 2011). NICIL-2, I. album, M. roseus e R. marinus manca di tutti i geni necessari per l’ossidazione di composti solforati ridotti.

Biosintesi degli amminoacidi

Il genoma NICIL-2 manca di molti geni chiave per la biosintesi degli amminoacidi. Le vie complete sono codificate per alanina, arginina, asparagina, aspartato, β-alanina, glutammato, glicina, lisina e metionina. NICIL-2 manca di ilvC e leuABCD e quindi possiede percorsi incompleti per la biosintesi di valina, leucina e isoleucina. Allo stesso modo, la I. il genoma di album mancava di tutti i geni richiesti per la biosintesi di valina, leucina e isoleucina dal piruvato, ad eccezione della catena ramificata amino transferasi (ilvE), mentre M. roseus e C. tepidum contengono percorsi completi. Né NICIL-2 né I. album codificano i geni necessari per la biosintesi della prolina dal glutammato (proBAC), mentre sia C. tepidum che M. roseus lo fanno. Il gene serbo per la biosintesi della serina manca in NICIL-2, I. album, M. roseus, e si trova in alcuni GSB, tra cui C. tepidum. NICIL-2 può anche utilizzare aminoacidi come substrati di crescita. Complete degradation pathways are present for branched-chain amino acids (leucine, isoleucine and valine), similar to pathways observed in ‘Candidatus Thermochlorobacter aerophilum’ (Liu et al., 2012b).

Electron transport

The major electron transport chain components were identified in the NICIL-2 genomes including: NADH:ubiquinone oxidoreductase (Complex I, EC 1.6.5.3), membrane-bound succinate dehydrogenase (Complex II, EC 1.3.5.1), quinol-oxidizing alternative Complex III (ACIII) (Yanyushin et al., 2005; Pereira et al., 2007), several cytochrome c oxidases (Complex IV, EC 1.9.3.1) and an F-type H+-transporting ATPase (Complex V, EC 3.6.3.14). NICIL-2 contains one complete set of genes for NADH:ubiquinone oxidoreductase (14 subunits, nuoABCDEFGHIJKLMN), although they are not assembled in one operon (Supplementary Figure S6). Invece, la maggior parte dei geni sono disposti indipendentemente in tutto il più grande scaffold NICIL-2 (nuoGHI, nuoJK, nuoF, nuoD, nuoE e nuoMN), ei geni rimanenti si trovano su tre scaffold più piccoli (nuoAB, nuoL e nuoC), indicando che l’assenza di una struttura operonica non è un artefatto di assemblaggio. C. tepidum contiene un insieme di geni che codificano per il NADH: l’ubichinone ossidoreduttasi che manca di nuoEFG (11 subunità). I. album e M. roseus contengono due serie di nuoABCDHIJKLMN e una serie di nuoEFG ciascuna (Figura supplementare S6). È interessante notare che il complesso I di NICIL-2 è più strettamente correlato a quelli di Rhodothermus marinus e Salinibacter ruber dei Bacteroidetes, entrambi contenenti un set completo di geni per NADH:ubichinone ossidoreduttasi (Figura 5a). Omologhi per il complesso 11 subunità I sono stati identificati anche in tutti e sei NICIL – 2 relativi bidoni recuperati da Yellowstone e Great Boiling Spring, e un assemblaggio concatenato di queste sequenze proteiche cluster con le sequenze da NICIL-2.

L’ACIII è una nuova classe di ossidoreduttasi a membrana batterica che si trova in organismi che spesso mancano del complesso bc1 (Yanyushin et al., 2005). L’ACIII di R. marinus (Pereira et al., 2007; Refojo et al., 2013) e batterio fototrofico anossigenico filamentoso Chloroflexus aurantiacus (Gao et al., 2009, 2013) è stato purificato e studiato. Recentemente, un gran numero di cluster di geni che codificano per le subunità ACIII, con variazioni nella costituzione e nell’organizzazione, sono stati trovati in una gamma di genomi batterici (Refojo et al., 2013). Ad esempio, R. marinus contiene i geni actABCDEF in un operone che codifica sei subunità ACIII; gli omologhi di questo cluster genico sono stati identificati in più membri dei Bacteroidetes (Thiel et al., 2014). Un albero filogenetico descrive la relazione di ACIII da NICIL-2 ai suoi parenti più stretti (Figura 5b). I GSB non possiedono ACIII e quindi non sono rappresentati in questo albero. Tuttavia, ” Candidatus Thermochlorobacter aerophilum, che non è un membro del GSB, codifica un ACIII che probabilmente funziona nella respirazione aerobica (Liu et al., 2012b). È importante notare che sia I. album che M. roseus sono unici tra questo insieme di ACIII in quanto contengono cinque subunità, con le subunità actDE identificate come una proteina di fusione. Un complemento completo di geni che codificano per tutte le subunità ACIII, che sono state recuperate da due bidoni genoma NICIL-2-correlati dai metagenomi Yellowstone, sono stati trovati per contenere la fusione actDE e raggruppati con I. album e M. roseus. NICIL-2 non contiene questa fusione e i geni per il suo complesso ACIII sono più strettamente correlati a R. marinus e S. ruber.

Gli accettori di elettroni terminali NICIL-2 includono una citocromo c ossidasi di tipo aa3 (Complesso IV) e possibili ossidasi alternative del citocromo c, annotate come CoxMOP. È improbabile che NICIL-2 sia microaerofilo perché le ossidasi di tipo cbb3 non sono state rilevate nel genoma. Inoltre, il citocromo bd non è stato rilevato. Per confronto, entrambi i genomi di I. album e M. roseus contengono geni per il citocromo c ossidasi di tipo cbb3 e un complesso del citocromo bd.

Il genoma NICIL-2 contiene un insieme incompleto di geni men per la sintesi del menaquinone. Un percorso biosintetico completo di menaquinone contiene menFDHCEBAG (Bentley e Meganathan, 1982) e il genoma NICIL-2 include solo menBAG. Per confronto, C. tepidum e I. l’album contiene percorsi completi di uomini, mentre i genomi M. roseus e R. marinus hanno annotazioni per tutti i geni richiesti tranne menB e menH, rispettivamente. Omologhi di geni che codificano enzimi della via biosintetica alternativa del menaquinone, la via futalosina (Arakawa et al., 2011), sono stati inosservati in NICIL-2. Anche i geni biosintetici dell’ubiquinone sono assenti. Il genoma NICIL-2 può avere una copertura incompleta in quest’area e altri geni men possono essere trovati con un genoma completamente assemblato. In alternativa, NICIL-2 può impegnarsi in uno scambio di chinoni con altri membri della comunità, come osservato per il consorzio fototrofico “Chlorochromatium aggregatum” (Liu et al., 2013).

Flagelli e chemiotassi

I geni che codificano le proteine per il corpo basale, il gancio e l’assemblaggio del filamento sono presenti nel genoma NICIL-2. Tuttavia, NICIL-2 manca di geni che codificano macchine chemiotassi, a parte una proteina regolatrice, CheY. I GSB sono considerati non mobili e mancano di chemiotassi e flagelli, mentre I. album, M. roseus e R. marinus hanno macchinari flagellari e chemiotassi.