RNA circolare: funzioni, applicazioni e prospettive

Introduzione

L’RNA circolare (circRNA) è stato scoperto nei virus a RNA come viroidi a metà degli anni ‘ 70, inizialmente ipotizzato essere un errore di splicing dell’RNA endogeno . Grazie all’avanzamento nell’analisi computazionale e nelle tecniche di sequenziamento dell’RNA nello stesso decennio, queste strutture circolari incomprese sono state finalmente riconosciute correttamente e profondamente sia nella struttura che nella funzionalità . Al suo interno, il circRNA è un RNA a singolo filamento, ma differisce dall’RNA lineare molto più noto in quanto si chiude continuamente su se stesso unendo covalentemente le sue estremità 5′ e 3’, presentando così alcune proprietà affascinanti che non sono completamente esplorate: impalcatura del complesso proteico, modulazione genica parentale, interazioni RNA-proteine e spugna microRNA (miRNA), solo per citarne alcuni . Essi sono ora considerati per fornire una funzione di regolamentazione essenziale per le piante e gli animali allo stesso modo . Un numero crescente di gruppi di studio ha dimostrato e verificato in una certa misura il livello di efficacia e di efficacia mostrato negli RNA circolari che è tipicamente richiesto in trattamenti medici praticabili e in altre applicazioni biotecnologiche. Ad esempio, vengono spesso segnalati casi di biomarcatori tradizionali ampiamente sovraperformati dai sostituti circRNA proposti. Sostenuta da un crescente sostegno e prove circa le capacità promosing di CIRCRNA, più indagine e interesse dovrebbe essere portato come tale, non solo da una comprensione biologica completa di base delle sue strutture e meccanismi, ma anche a livello sistematico delle loro interazioni con le molecole e gli ambienti circostanti. In termini applicativi, i CIRCRNA sono alla pari in termini di potenziale e vitalità per colpire il cancro e altre malattie maligne con altri nuovi trattamenti come la medicina personalizzata e le terapie con cellule staminali.

Caratteristiche dei CircRNA

I CIRCRNA sono generalmente costituiti da 1-5 esoni e gli introni che fiancheggiano gli esoni sono fino a 3 volte più lunghi della loro controparte lineare. Un’analisi più approfondita ha rivelato la presenza di molte ripetizioni di Alu inverter complementari nei segmenti di introne, portando alcuni a ipotizzare che questa particolare disposizione faciliti effettivamente i siti di giunzione per localizzarsi facilmente l’un l’altro e promuovere la circolarizzazione. Dal momento che sono strettamente-loop strutture, non ci sono effettivamente 5′ e 3′ end strutture come poli-A code e 5′ caps in circRNA, rendendoli immuni alla scissione esonucleasi . Empiricamente, durano 2,5 volte più a lungo delle loro controparti lineari nelle cellule mammarie, come illustrato in uno studio condotto da Enuka et al. . A causa di queste proprietà fisiche, tecniche di screening di laboratorio comuni come la degradazione della RNasi R – un enzima che degrada esclusivamente l’RNA lineare – così come il test della coda poli-A possono selezionare con precisione strutture chiuse in loop su forme lineari. Diversi gruppi di ricerca negli ultimi anni hanno spostato la loro attenzione sull’identificazione di potenziali isoforme circRNA, strutture che sono originariamente espresse dallo stesso DNA parentale ma sono leggermente diverse l’una dall’altra nella sua forma matura finale a causa della differenziazione nella specificità degli spliceosomi per riconoscere esoni e introni sul filamento pre-mRNA . I gruppi più importanti sono Salzman, Jeck, Memczak, Guo e Zhang . Come tale l’incredibile diversità di CIRCRNA spiegato: 20.000 tipi diversi sono stati identificati in eucarioti finora, un numero che rimane fino ad oggi open-ended .

CircRNA biogenesi e classificazione

La formazione di CIRCRNA deriva dal posizionamento e dallo scrambling dei gruppi esone e introne, che sono segmenti che vengono riservati ed eliminati nel prodotto finale post-trascrizionalmente modificato rispettivamente . Normalmente un RNA messaggero maturo si forma quando un complesso proteina-RNA chiamato spliceosoma catalizza la scissione dei segmenti di introne in una molecola precursore-mRNA, di solito attraverso il riconoscimento di sequenze specifiche che fiancheggiano il segmento di introne ad entrambe le estremità. I segmenti esonici si fondono, mentre i segmenti intronici vengono conseguentemente eliminati e degradati. Questa percezione convenzionale non prende in considerazione la deviazione e la differenza di potenza in tutti i siti di giunzione , alcuni dei quali, di conseguenza, lo spliceosoma può ignorare e inevitabilmente portare alla sintesi di circRNA. Inoltre, il contributo della disposizione spaziale del sito di giunzione 5′ e 3 ‘ non deve essere ignorato, poiché se il primo è posizionato a valle del secondo, allora lo spliceosoma costruisce favorevolmente una struttura circolare chiusa covalentemente su una molecola esonica lineare . Questo meccanismo, comunemente indicato come “Scrambling dell’esone” dà origine a diversi tipi di CIRCRNA tra cui esonica, intronica, esone-intronica e intergenica . Nei casi specifici del cancro, la struttura interna è ancora più difficile da determinare a causa della natura espansiva e quindi invasiva dei tumori maligni . Abbiamo brevemente descritto la biogenesi e la funzionalità di circRNAs in Fig. 1.

Cenni sulla Biogenesi e funzionalità dell’RNA Circolare. Spiegazione e note a piè di pagina: a un RNA messaggero nella sua forma matura, in cui l’interazione tra esoni e introni è assente. b Circolarizzazione guidata da Lariat. L’esone a monte (esone 1) e l’esone a valle (esone 4) sono legati in modo covalente a causa dell’mRNA che viene impiombato. Ciò facilita la produzione di un RNA lariat insieme agli esoni accoppiati che rimangono, che sono Esoni 2 e 3. circolarizzazioni guidate da proteine leganti il c RNA e da intron-pairing. In entrambi i casi, a monte e a valle introni (introni 1 e 3) sono appaiati a fornire opportunità per il sandwich di Esoni (esoni 2 e 3) per interagire, l’unica differenza è che con il primo caso, un esterno RBP molecola unisce l’equazione attivamente per facilitare la reazione, mentre con Introne-associazione Guidata Circularisation, il gruppo ossidrile e il gruppo fosfato di upstream e downstream introni, rispettivamente in coppia in modo indipendente. d ecircRNA o ElcircRNA viene prodotto indipendentemente dalla via di circolarizzazione. In alcuni casi, i segmenti intronici risiedono nel ciclo, quindi dando origine a ELCIRCRNA al contrario di ecircRNA che contiene segmenti puramente esonici. le funzionalità di CIRCRNA mature includono la spugnatura del miRNA, che agisce come un doppio inibitore per alcune reazioni chimiche; La traduzione proteica è possibile, anche se piuttosto rara e la ricerca è in corso per capire come differisce dalle traduzioni lineari dell’RNA; Le formazioni complesse di proteine RBP aiutano a regolare e moderare i percorsi e influenzano indirettamente la produzione di altri CIRCRNA; Interazioni dell’mRNA, sia esso facilitativo o inibitorio

Funzione CircRNA: spugne microRNA

A causa dell’unicità nelle strutture di circRNA, non codificano per proteine come le forme lineari . Gli studi hanno dimostrato, con prove empiriche di supporto, che alcuni CIRRNA agiscono come spugne microRNA e ostacolano efficacemente il loro meccanismo. I microRNA sono sequenze di RNA non codificanti lunghe 21-nt che aiutano nella regolazione post-trascrizionale dell’espressione genica, tipicamente agganciandosi agli MRNA e inibendo la sua traduzione in proteine tramite modalità competitiva o non competitiva. Sono classificati in famiglie in base alle loro regioni di semi, a seconda che condividano la stessa sequenza di nucleotidi dalle posizioni 2 a 7 . I CIRRNA possiedono la complementarità per contro-attaccarsi sui microRNA, riconoscendo le regioni del seme dei miRNA e disattivandoli competitivamente. Due CIRRNA in particolare, rispettivamente CDR1as e circSRY, sono attualmente al centro della ricerca scientifica. Si osserva che CDR1as contiene 70 siti di legame conservati per miRNA-7, molto significativi rispetto a qualsiasi altra spugna miRNA lineare. La sua capacità di spugnatura è confermata da Memczak et al. , che ha utilizzato il sequestro delle molecole di CDR1as contro l’espressione elevata di miR-7 in cervelli zebrafish per ottenere la prova di sostegno delle attività inibitorie di CDR1as contro il miRNA mirato a monitorando gli sviluppi successivi del mesencefalo zebrafish. CircSRY, d’altra parte, è testato nei testicoli murini e si nota il suo attacco complementare alla regione del seme miR-138 . Poiché contiene 16 siti di legame specifici, un numero ancora impressionante tra tutte le molecole di spugna, la loro ipotesi di funzionalizzazione della spugna è confermata .

Funzione del CircRNA: interazione con RBPs e traduzione della proteina

Alcuni hanno trovato il circRNA per regolare la trascrizione e l’espressione del gene via altre vie. Possono interagire con le proteine leganti RNA (RBPS) come circ-Foxo3 e insieme formano un complesso che influisce sulla sopravvivenza e sulla proliferazione cellulare interagendo con p21 e CDK2 ; alcuni rafforzano la stabilità dell’mRNA formando strutture duplex come nel caso di CDR1as. Su una nota più controversa, gruppi come Legnini I. et al. e Pamudurti N. R. et al. scoperto che alcuni CIRCRNA possono tradurre per proteine, uno in mioblasti murini e uno in teste di mosca . Tali notizie portano avanti nuove ipotesi ‘ sulle capacità circRNA, convenzionalmente pensato per essere non-codifica . Dalla prima scoperta di proteine tradotte dal virus dell’epatite-un circRNA a singolo filamento, alcuni hanno verificato l’attivazione della capacità traslazionale del circRNA inserendo un IRES (internal ribosome entry site) a monte del codone di partenza . Molto di più è necessario fare per comprendere appieno l’esatto meccanismo traslazionale di questi CIRRNA, e perché funzionano mentre la maggior parte degli altri non lo fanno.

CircRNA application potential

In una nota più pratica, i CIRCRNA sono biomarcatori vitali per la diagnosi e il trattamento di malattie in quanto non possono essere facilmente degradati dalle esonucleasi a causa della loro struttura circolare chiusa. In alcuni casi, circRNAs sono stati trovati a briscola biomarcatori convenzionali. Ad esempio, l’upregulation di circ-PVT1 nei tessuti del cancro gastrico (GC) migliora l’attività di spugnatura di miR-125 e successivamente incoraggia la proliferazione di GC ; hsa_circ_0000190 ha anche attirato l’attenzione operando proprio nel modo opposto – downregulation si verifica quando entra in contatto con GC, ed è testato per essere più sensibile e specifico di biomarcatori come CEA e CA 19-9 . Un altro esempio è nel carcinoma epatocellulare (HCC), dove il biomarcatore presente nell’uso predominante è l’alfa-fetoproteina (AFP) . AFP mostra scarsa sensibilità, per cui il 40% di tutti i pazienti con HCC ha testato livelli normali di AFP. Il modo costruttivo per aumentare questa sensibilità è la combinazione con altri marcatori, che non è una soluzione efficace. In alternativa, Xingchen Shang et al. ha suggerito la correlazione tra circ_005075 e la dimensione del tumore , elencandolo come un biomarcatore prognostico vitale che è superiore sia in efficacia che potenziale a causa della loro stabilità e specificità. Ciò suggerisce che lo sviluppo e l’invasione degli HCC sono strettamente legati ai CIRCRNA, anche se il suo meccanismo completo non è ancora chiaro. Tuttavia, l’elenco dei biomarcatori circRNA fattibili applicabili alla ricerca sul cancro non è limitato alle sole due malattie. Abbiamo riassunto gli studi disponibili riguardanti le CIRCRNA coinvolte in varie malattie umane che possono essere trovate nella Tabella 1.

Ulteriori studi recenti hanno identificato e sta tentando di decodificare l’arricchimento e la stabilità di circRNAs in fatto, una combinazione che potrebbe migliorare ulteriormente la capacità di targeting di circRNAs. Gli esosomi sono vescicole extracellulari la cui funzione principale è quella di trasportare vari contenuti cellulari, sostanze chimiche e fattori, consentendo così l’interazione e la risposta cellula-cellula . Come tale, un numero considerevole di cambiamenti cellulari e risposta tissutale sono una conseguenza del fatto che la sua corrispondente vescicola della stessa compatibilità abbia raggiunto con successo la sua destinazione e risposte illicited o fattori trasportati . Acquisire una comprensione del meccanismo dell’esosoma può aiutare a derivare mediazioni sui microambiente tumorali e sul networking intercellulare, suscitando quindi un grande interesse per il circRNA dell’esosoma di recente alla luce della possibilità di una maggiore efficacia e capacità di targeting su cellule maligne o malfunzionanti.

L’origine dei CIRCRNA dipende in ultima analisi dai corrispondenti livelli di miRNA nelle loro cellule donatrici, che possono essere sia di natura immunitaria che non immunitaria. Gli RNA degli esosomi possono ridurre al minimo i danni al DNA accelerando il ciclo cellulare, come dimostrato in un recente caso di sovraespressione di miR-217, con conseguente riduzione delle espressioni clclin-D1 e EZH2. Si ritiene che questo comportamento sia legato alla proliferazione deregolamentata nelle formazioni di neoplasmia . Inoltre, molti risultati sperimentali hanno concluso la relazione diretta tra esosomi e trasformazione neoplastica, così come l’effetto meccanicistico di circRNA sul microambiente tumorale . Prendendo ad esempio l’adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC), è stata associata l’alta espressione anormale dell’esosoma circc-PED8A ; l’esosoma circNRIP1 promuove metastasi nel cancro gastrico (GC) spugnando miR-149-5p, in un altro studio. Forse più significativo è il ruolo exosoma circPTGR1 ha sullo sviluppo del carcinoma epatocellulare (HCC) , per cui upregulating il circRNA esosoma incoraggiato invasione tumorale. A causa di questi risultati altamente correlazionali, i CIRCRNA esosomi sono proposti come indicatori diagnostici per i loro corrispondenti tumori maligni in base al modo in cui gli intervistati sono in grado di cambiare i livelli di espressione e la loro eccellente stabilità, unita al suo innato meccanismo di consegna mirato . Ad oggi, oltre 1000 CIRCRNA sono stati identificati negli esosomi in tutto il corpo umano, con ulteriori ricerche condotte sulla scoperta di combinazioni extra esosoma-circRNA-cancro.

Sfide e prospettive del CircRNA

Nonostante la crescente ricerca sia stata condotta in parallelo con l’aumento della popolarità del circRNA, la funzione biologica della maggior parte dei CIRCRNA rimane ancora un mistero. Ad esempio, si osserva che la maggior parte dei CIRCRNA pattuglia nel citoplasma, ma provengono dal nucleo della cellula, quindi viene sollevata la questione di come si inseriscono attraverso il piccolo poro nucleare. Inoltre, il fatto che molti degli esoni circolarizzati (85%) si sovrappongano a sequenze codificanti proteine, ma la maggior parte dei CIRCRNA non codificano per proteine rimane da studiare. Su una nota più clinica, richiedono ulteriori test per essere in grado di sostituire completamente le procedure diagnostiche tradizionali. Preoccupazioni come l’estrazione del tessuto del paziente che causa traumi e la costosa rilevazione del circRNA nel tessuto devono essere affrontate insieme all’ottenimento di una comprensione completa e completa per quanto riguarda le loro strutture secondarie e ruoli diversi tra loro. La mancata somministrazione di biomarcatori circRNA adeguati nei pazienti può offuscare i risultati clinici che devono essere superati ottenendo un quadro migliore della generazione, della localizzazione e della degradazione dei CIRCRNA proposti.

Tuttavia, i CIRRNA sono ancora opzioni interessanti per lo sviluppo di una serie di strumenti terapeutici biologici. Ci sono già rapporti di costruzione di RNA sia in vitro che in vivo che utilizzano sequenze intron-esone permutate del gruppo I (PIE) per il targeting complementare di sequenze di fiancheggiamento spliceosomiale-backsplice-site, e questo meccanismo può essere estrapolato per includere qualsiasi sequenza o proteina di struttura nota, se lo desideriamo. Come nota a margine, c’è molto margine di miglioramento nell’ampliare la diversità delle possibilità diagnostiche di circRNA. In un esempio, l’analisi molecolare attuale di sangue è trattenuta ad analizzare i frammenti cell-free di genomic-DNA; Una grande prospettiva futura sarebbe quella di prendere in considerazione il campionamento di vescicole extra-cellulari specifiche per monitorare l’insorgenza e la progressione della malattia con maggiori dettagli. Queste idee gettano le basi per ulteriori suggerimenti sulla regolazione selettiva delle proteine e sulla segnalazione cellulare programmata. Come dimostrato più e più volte in esperimenti in corso, i CIRCRNA hanno mostrato con sicurezza il loro potenziale di spugnatura e biomarcazione, il che dovrebbe spingerci a svelare i segreti dei CIRCRNA a lungo incompresi.