Sequenza Completa del Genoma di Clostridium innocuum Ceppo ATCC 14501

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riportiamo la sequenza completa del genoma di Clostridium innocuum ceppo ATCC 14501, che è stato identificato nel 1962, dopo l’isolamento da un ascesso appendicolare (1). Era caratterizzato come un’asta Gram-positiva con spore terminali. Le colonie erano da 1,5 a 2,5 mm di diametro, lucide, bianche, sollevate e non emolitiche. L’inoculazione intraperitoneale del surnatante di coltura nei topi non è risultata patogena. Da allora, C. innocuum è stato considerato un microrganismo gastrointestinale benigno (1).

Ora, il potenziale patogeno di C. innocuum viene riconsiderato. Recentemente, Chia e colleghi hanno riferito che C. innocuum è la seconda specie clostridiale più comune che causa un’infezione extraintestinale (2) ed è una causa di un’infezione intestinale simile a Clostridioides difficile (3). Questi isolati erano resistenti alla vancomicina, citotossici per le cellule Vero e HT-29 e enteropatogeni nei topi (3). Con questa riconsiderazione della patogenicità di C. innocuum, è necessaria la sequenza completa del genoma del ceppo ATCC 14501.

Il DNA genomico (gDNA) per le librerie Illumina e Nanopore è stato estratto utilizzando il BiOstic bacteremia DNA isolation kit (Qiagen, Germantown, MD) da una coltura overnight coltivata anaerobicamente in brodo di soia triptico a 37°C. Le librerie di sequenziamento a lunga lettura sono state preparate da gDNA non sheared utilizzando il ligation sequencing kit SQK – LSK109 (Oxford Nanopore, UK) e sequenziate sulla piattaforma MinION . I parametri predefiniti sono stati utilizzati per tutto il software se non diversamente specificato. Guppy v3.4.5 è stato utilizzato per basare le letture delle chiamate con il modello ad alta precisione R9.4. 1 e per eseguire il filtraggio della qualità di lettura basato su punteggi Q, demultiplexing e trimming del codice a barre. La copertura di lettura approssimativa era 98× da 19.646 letture per un totale di 460,0 Mbp. Il valore letto N50 era 22.933 nucleotidi e il valore L50 era 7.784 letture. La qualità di lettura del nanoporo è stata valutata utilizzando pycoQC v2.5.0.21 (4).

Librerie di sequenziamento a lettura breve sono state preparate da gDNA utilizzando il kit Nextera XT (Illumina, San Diego, CA) e sequenziate sulla piattaforma Illumina MiSeq utilizzando una cella di flusso v3 per produrre 482.327 coppie di letture da 301 bp. Gli adattatori di sequenziamento sono stati tagliati da reads on-instrument per generare 196,3 Mbp di sequenza, con una copertura approssimativa del genoma di 42×. La qualità di lettura Illumina è stata valutata utilizzando FastQC v0.11. 2 (5). Per ridurre al minimo le chiamate di variante false positive nei tracciati, non è stato eseguito alcun ritaglio di qualità delle letture Illumina (6).

Il genoma è stato assemblato con Nanopore legge passando Q score filtering utilizzando Flye v2.6 per generare un singolo contig 4,30 Mb (7). Le letture illuminate dall’adattatore sono state allineate all’assembly utilizzando BWA v0.7.17 e gli errori di assemblaggio sono stati corretti utilizzando Pilon v1. 23 con un’impostazione mind mindepth di 0.1 (8, 9). L’allineamento in lettura seriale e la correzione Pilon sono stati eseguiti tre volte fino a quando non sono state generate ulteriori correzioni di assemblaggio. Il software personalizzato (Pilon Tools v0.1) (https://github.com/egonozer/pilon_tools) è stato utilizzato per identificare, valutare manualmente e correggere eventuali errori di assemblaggio omopolimeri residui. Circolatore v1. 5.5 è stato utilizzato per garantire la circolarizzazione del cromosoma tagliando le estremità sovrapposte e ruotando fino all’inizio del gene dnaA (10). L’assemblaggio finale è una singola sequenza cromosomica con una lunghezza di 4.718.906 bp e un contenuto di GC del 43,6%. L’annotazione è stata eseguita utilizzando la pipeline di annotazione del genoma procariotico NCBI (PGAP) v4.11 (11, 12).