Sintesi di collagene
Regolazione della sintesi di collagene osseo
La sintesi di collagene in colture di organi di calvarie di roditori e colture cellulari è stata valutata utilizzando diversi test . Nel test più utilizzato, le calvarie e le cellule vengono incubate con prolina radiomarcata per diverse ore prima della fine della coltura. L’incorporazione della prolina radiomarcata nella proteina collagenasi-digeribile (etichettatura CDP) e nella proteina non collagen (etichettatura NCP) viene misurata in estratti delle colture utilizzando collagenasi batterica altamente purificata . La sintesi percentuale di collagene viene calcolata dai valori CDP e NCP dopo aver corretto la maggiore abbondanza di prolina nel collagene rispetto alle proteine non collagene . La produzione di collagene può anche essere determinata misurando il contenuto di idrossiprolina delle colture di cellule o organi, poiché l’idrossiprolina è praticamente unica per i collageni. Questi metodi non distinguono tra diversi tipi di collagene fibrillare. Tuttavia, il collagene sintetizzato dalle colture di organi ossei e dalla maggior parte delle colture cellulari osteoblastiche è in gran parte di tipo I (>95%), in modo che il valore di etichettatura CDP rifletta solitamente la sintesi di collagene di tipo I. Se lo si desidera, la produzione di diversi tipi di collagene può essere distinta dalla cromatografia a scambio ionico e dall’elettroforesi su gel di poliacrilammide di estratti radiomarcati di colture cellulari o di organi . L’espressione del collagene di tipo I nelle colture cellulari umane è stata valutata anche misurando la secrezione del propeptide del procollagene I C-terminale . Infine, sonde cDNA specifiche in Northern blotting e primer allele-specifici in test di reazione a catena transcriptasi-polimerasi inversa sono stati utilizzati per valutare l’espressione di mRNA di collagene nei modelli ossei. La misurazione dell’effetto di 1,25(OH)2D3 sulla sintesi del collagene e sui livelli di mRNA ha dato risultati comparabili utilizzando questi diversi saggi.
1,25(OH)2D3 inibisce la sintesi del collagene in colture di organi di calvarie di ratto fetale di 21 giorni e calvarie di topo neonatale con scarso o nessun effetto sulla sintesi proteica non collagene. L’inibizione massima di sintesi del collagene da 1,25 (OH) 2D3 in calvarie del ratto (circa 50%) accade a 10 nanometro . 1,24 R, 25 – (OH)3D3 inoltre inibisce la sintesi del collagene ma è meno potente di 1,25 (OH)2D3 . 25 – (OH)D3 e 24R,25 (OH)2D3 non alterano la sintesi del collagene al di sotto di 100 nM . I metaboliti della vitamina D inibiscono la sintesi del collagene e stimolano il riassorbimento delle ossa lunghe fetali del ratto con potenze relative simili che si correlano con l’affinità dei metaboliti per i VDR scheletrici . Per determinare la selettività cellulare dell’inibizione 1,25(OH)2D3 della sintesi del collagene, le colture di organi di calvarie di ratto fetale sono state trattate con 1,25(OH)2D3 per 22 h e quindi incubate con prolina tritiata per le 2 h finali di coltura. L’osso centrale (osteoblasti maturi) è stato sezionato privo del periostio (osteoprogenitori e fibroblasti meno maturi) ed entrambi i compartimenti sono stati analizzati separatamente per l’incorporazione di prolina tritiata. 1,25(OH)2D3 diminuisce la sintesi del collagene nell’osso centrale ma non nel periostio, indicando la selettività dell’effetto 1,25 (OH)2D3 per gli osteoblasti maturi . Utilizzando un protocollo in vivo in cui ai ratti neonatali sono state somministrate iniezioni multiple di prolina tritiata a matrice ossea di nuova sintesi radiolabel, 25 ng di 1,25(OH)2D3 somministrati nei giorni 1, 3 e 5 hanno inibito la sintesi della matrice ossea valutata mediante istomorfometria di autoradiografi di tibia e calvarie .
1,25(OH)2D3 inibisce anche la produzione di collagene nelle cellule ROS 17 / 2.8 dell’osteosarcoma osteoblastico del ratto , nelle cellule osteoblastiche primarie del ratto e del topo e in una linea cellulare immortalata dell’osteoblasto murino (MMB-1). 1,25 (OH) 2D3 ha un maggiore effetto inibitorio sulla sintesi del collagene di tipo I durante la crescita in fase di log delle cellule osteoblastiche murine primarie rispetto alla confluenza, forse perché le cellule proliferanti contenevano più VDR . Allo stesso modo, l’inibizione 1,25(OH)2D3 della sintesi del collagene è maggiore nelle colture sparse di cellule MMB-1 che hanno livelli VDR più elevati rispetto alle cellule MMB-1 confluenti . 1,25 (OH)l’inibizione 2D3 della sintesi del collagene è equivalente nelle cellule osteoblastiche primarie del ratto sparse e confluenti , ma il numero di VDR non è cambiato durante la crescita delle cellule . Presi insieme, questi dati mostrano che l’entità dell’inibizione della sintesi del collagene da parte di 1,25(OH)2D3 è in gran parte determinata dalla quantità cellulare di VDR. 1,25 (OH) 2D3 inibisce i livelli di mRNA di collagene durante la fase proliferativa di colture a lungo termine di cellule osteoblastiche primarie di ratto e previene la formazione di noduli ossei mineralizzati da queste colture . Questi studi dimostrano che 1,25 (OH) 2D3 inibisce la differenziazione degli osteoprogenitori che formano noduli mineralizzati in colture cellulari osteoblastiche primarie di ratto . Tuttavia, l’inibizione della formazione di noduli da 1,25 (OH) 2D3 può essere secondaria alla soppressione della sintesi di collagene di tipo I nelle colture.
In contrasto con gli effetti inibitori sopra descritti, 1,25 (OH)2D3 stimola transitoriamente la sintesi proteica di collagene e non collagene (circa due volte), che raggiunge un picco tra 12 e 24 h, nella linea cellulare osteoblastica murina immortalata MC3T3-E1 . In questo studio, la percentuale di collagene sintetizzata dalle colture (collagene rispetto alla sintesi proteica totale) non è stata riportata; di conseguenza, non è stato possibile determinare la selettività dell’effetto 1,25 (OH)2D3 per la sintesi del collagene. 1,25 (OH) 2D3 aumenta anche l’espressione di collagene nella linea cellulare osteoblastica umana osteosarcoma MG-63 e colture primarie di cellule osteoblastiche umane . È interessante notare che l’aumento della sintesi del collagene di 1,25 (OH)2D3 nelle cellule MG63 è bloccato dalla proteina legante il fattore di crescita insulino-simile 5, che interagisce direttamente con il VDR e impedisce l’eterodimerizzazione con il recettore retinoide X RXR . Tuttavia, in altri studi, 1,25 (OH)2D3 ha dimostrato di diminuire la sintesi percentuale di collagene nelle cellule MC3T3-E1 . MC3T3-E1 e MG-63 rappresentano cellule preosteoblastiche che subiscono differenziazione osteogenica in vitro con acido ascorbico; 1,25(OH)2D3 inibisce la crescita cellulare e aumenta l’espressione osteocalcina e l’attività della fosfatasi alcalina in entrambe le linee cellulari. Le cellule MC3T3E1, come la maggior parte delle linee cellulari osteoblastiche immortalate, mostrano una significativa variazione fenotipica . Pertanto alcuni di questi risultati discrepanti possono essere dovuti a variazioni nelle cellule utilizzate per gli esperimenti. Collettivamente, questi dati suggeriscono che 1,25 (OH) 2D3 può agire come un ormone differenziante nelle prime cellule del lignaggio degli osteoblasti, che si traduce in un aumento dell’espressione del collagene di tipo I. Al contrario, 1,25 (OH)2D3 inibisce l’espressione del collagene di tipo I negli osteoblasti maturi.
