Stabilizzazione di eterocromatina da OROLOGIO promuove il ringiovanimento delle cellule staminali e la rigenerazione della cartilagine

Anticorpi

Per western blotting: anti-OROLOGIO (#5157, 1:1.000 abitanti), anti-HP1a (#2616S, 1:1.000) e anti-HP1y (#2619, 1:3,000) dal Cell Signaling Technology; anti-KAP1 (Ab22553, 1:2.000 e), anti-Lamina B1 (Ab16048, 1:1.000) e anti-LBR (Ab32535, 1:1000) e da Abcam; anti-β-actina (sc-69879, 1:3,000) da Santa Cruz Biotechnology.

For immunostaining: anti-Ki67 (ZM0166, 1:500) from ZSGB-BIO; anti-γH2AX (05-636, 1:400) from Millipore; anti-53BP1 (A300-273A, 1:500) from Bethyl Laboratories; anti-FOXA2 (8186S, 1:100) from Cell Signaling Technology; anti-SMA (A5228, 1:100), and anti-TuJ1 (T2200, 1:100) from Sigma-Aldrich; anti-H3K9me3 (Ab8898, 1:500) and anti-NANOG (Ab21624, 1:200) from Abcam; anti-Lamin A/C (sc-376248, 1:500), anti-OCT3/4 (sc-5279, 1:200) and anti-SOX2 (sc-17320, 1:100) from Santa Cruz Biotechnology; anti-Aggrecan (AF1220, 1:100), anti-Osteocalcin (MAB1419, 1:100), and anti-FABP4 (AF3150, 1:100) dai sistemi R&D.

Per la citometria a flusso: anti-CD73 (550257, 1:200), anti-CD90 (555595, 1:200), anti-CD44 (550989, 1:200), anti-HLA-ABC (560168, 1:100), anti-CD34 (555822, 1:200), anti-CD43 (560198, 1:200), anti-CD45 (555482, 1:200), anti-CD14 (555398, 1:200) e anti-CD19 (555415, 1:200) da BD Biosciences; anti-CD105 (17-1057-41, 1:200) e anti-PDPN (17-9381-42, 1:200) eBioscience (San Diego, CA, USA); anti-CD29 (303004, 1:200), e anti-CD13 (301705, 1:200), anti-CD166 (343903, 1:200) e anti-CD164 (324805, 1:200) Biolegend (San Diego, CA, USA).

Coltura cellulare

CLOCK+/+ hESCs (hESCs, line H9, Wicell Research Institute) e CLOCK−/− hESC sono stati mantenuti su strati di alimentazione che consistevano in fibroblasti embrionali di topo mitomicina C-inattivati (MEFS) nel mezzo di coltura hESC. Il mezzo di coltura hESC conteneva DMEM / F12 (Thermo Fisher Scientific), 20% KnockOut Serum Replacement (Thermo Fisher Scientific), 0.1 mm aminoacidi non essenziali (NEAAs, Thermo Fisher Scientific), 2 mm GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific), 55 µM β-mercaptoetanolo (Thermo Fisher Scientific), 1% penicillina/streptomicina (Thermo Fisher Scientific) e 10 ng/mL bFGF (Joint Protein Central, Incheon, Corea). In alternativa, gli HESC sono stati coltivati su Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)-piastre rivestite in mTeSR medium (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada).

Sia derivato da hESC hMSCs e primaria hMSCs sono stati mantenuti in MSC mezzo contenente MEMa (Thermo Fisher Scientific) supplementato con 10% di siero bovino fetale (FBS) (Cat# 10099-141, Lotto# 1616964, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM NEAAs (Thermo Fisher Scientific), 1% di penicillina/streptomicina (Thermo Fisher Scientific), e 1 ng/mL bFGF (Joint Proteina Centrale, Incheon, Corea).

L’editing genico mediato da CRISPR/Cas9 in hESCs

L’editing genico mediato da CRISPR/Cas9 è stato eseguito tramite metodi precedentemente descritti con alcune modifiche.33,34,65 In breve, un RNA guida targeting esone 5 di CLOCK (CLOCK-gRNA) è stato clonato in un vettore di clonazione gRNA (#41824, Addgene) (Informazioni supplementari, Tabella S1). Previo trattamento con un inibitore ROCK Y-27632 (S1049, Selleck) per 24 h, hesc (5 × 106) sono stati risospeso in 100 µL di Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) contenenti il plasmide cocktail, che consisteva del donatore plasmide contenente l’omologia braccia, OROLOGIO gRNA e hCas9 (#41815, Addgene), e electroporated in 4D-Nucleofector sistema (Lonza). Le cellule sono state poi seminate su celle di alimentazione MEF. G418 (100 µg/mL, 11811023, Thermo Fisher Scientific) è stato aggiunto per avviare la selezione positiva 2-4 giorni dopo l’elettroporazione. Dopo 2 settimane di selezione, i cloni resistenti al G418 sono stati raccolti e trasferiti su una piastra a 96 pozzetti per ulteriori caratterizzazioni ed espansioni. PCR genomica e western blotting sono stati utilizzati per l’identificazione di editing genomico. Inoltre, abbiamo rimosso la cassetta di resistenza alla neomicina in CLOCK – / – hESCs tramite elettroporazione con il vettore pCAG-FLpo-2A-puro. Tre giorni dopo la trasfezione, 1 µg/mL di puromicina (Thermo Fisher Scientific) è stato utilizzato per arricchire le cellule resistenti alla puromicina per 48 h. Dopo 8-12 giorni di selezione, le colonie emergenti sono state raccolte e ampliate per lo studio successivo.

Generazione e caratterizzazione hMSC

Le HMSC sono state differenziate dalle HESC seguendo un protocollo precedentemente pubblicato.25,86,87 In breve, gli HESC sono stati dissociati in corpi embrioidi (EBs) e trattati con un mezzo di differenziazione (MEMa (Invitrogen) integrato con 10% FBS (Cat# 10099-141,Lot# 1616964, Thermo Fisher Scientific), 0.1mm NEAAs (ThermoFisher Scientific), 10 ng/mL bFGF, 5 ng/mL TGFß e 1% penicillina / streptomicina (Gibco)) su piastre rivestite con matrigel per 10 giorni fino alla confluenza del 95%. Successivamente, le cellule confluenti simili a MSC sono state digerite e placcate su piastre rivestite di matrigel trattate con terreno di coltura MSC contenente MEMa (Invitrogen) integrato con 10% FBS, 0,1 mm NEAAs, 1 ng/mL bFGF e 1% penicillina/streptomicina (Gibco). Quindi, le cellule confluenti simili a MSC sono state passate a piastre rivestite di gelatina. Gli HMSC sono stati purificati con diversi anticorpi corrispondenti a marcatori specifici hMSC (CD73, CD90 e CD105) da FACS. Le cellule triple positive CD73, CD90 e CD105 sono state ulteriormente caratterizzate da marcatori antigenici di superficie, inclusi marcatori positivi, come CD44, CD166, CD29, HLA-ABC e CD13, e marcatori negativi, come CD34, CD43, CD45, CD164, CD14, CD19 e PDPN. La funzionalità di hMSCs è stata ulteriormente verificata mediante differenziazione verso condrociti, adipociti e osteoblasti. Gli osteoblasti, i condrociti e gli adipociti derivati da HMSC sono stati caratterizzati dalla colorazione von Kossa (GMS 80045.3, GenMed Scientific Inc., USA) e colorazione osteocalcina (che indica osteogenesi), toluidina blu (T3260, Sigma) e colorazione aggrecan (che indica condrogenesi), e Olio rosso O (O1391, Sigma) colorazione (che indica adipogenesi) seguendo le istruzioni del produttore.

Isolamento e cultura delle HMSC primarie

Le HMSC primarie sono state isolate dalla gengiva di diversi individui.23,33,34,65 I tessuti separati dalla gengiva sono stati tagliati in piccoli pezzi (1 mm2) usando le forbici in TrypLE ™ Express Enzyme (1 ×) plus Dispase IV e ulteriormente incubati a 37 °C per 30 min. Le sospensioni di tessuto digerito sono state neutralizzate dal mezzo di coltura MSC e centrifugate a 200 × g per 5 min a temperatura ambiente. I pellet risultanti sono stati risospesi nel mezzo di coltura MSC contenente MEMa (Invitrogen) integrato con 10% FBS (Gibco), 1 ng/mL bFGF e 1% penicillina/streptomicina (Gibco) e placcato su piastre rivestite di gelatina per la crescita di HMSC primari.

Analisi del reporter di Luciferase

Il plasmide di PER2-dLuc era un regalo gentile da E. E. Zhang.88 Cellule che ospitano PER2-dLuc sono state coltivate a confluenza in piastre di coltura 24-well e sincronizzate con 20 µM forskolin (S2449, Selleck) per 2 h. Il mezzo è stato quindi sostituito con un mezzo di coltura MSC contenente luciferina da 0,25 mm (LUCK-1G, GoldBio). Le cellule sono state monitorate in un luminometro LumiCycle a 37 °C per 5-7 giorni; i dati generati sono stati analizzati con il software di analisi LumiCycle (Actimetrics). I dati del primo ciclo di 24 ore sono stati esclusi dalla nostra analisi statistica.

Sincronizzazione hMSC in vitro e analisi circadiana

Gli HMSC sono stati placcati su piastre rivestite di gelatina con mezzo MSC fino alla confluenza del 95%. Per la sincronizzazione, le cellule sono state quindi trattate con 20 µM forskolin per 2 h e ri-immagazzinate nel mezzo MSC dopo il lavaggio due volte con PBS. Le cellule sono state raccolte a partire da 24 ore di post-sincronizzazione a intervalli di 3 ore per 9 punti temporali, seguiti dall’estrazione dell’RNA e dal rilevamento RT-qPCR. Il test non parametrico JTK_CYCLE è stato utilizzato per verificare le oscillazioni circadiane come descritto in precedenza.89 Thread del corso temporale di HMSC con valori p e q < 0.05 sono stati considerati ritmici.

Western blotting

Le cellule sono state lisate in un buffer SDS contenente il 4% di SDS e Tris-HCl da 100 mm. La concentrazione di proteine è stata quantificata utilizzando un kit di quantificazione BCA (Thermo Fisher Scientific) e ~20 µg di proteine per campione sono stati sottoposti a SDS-PAGE e elettrotrasferiti a membrane PVDF (Millipore). Quindi, le membrane sono state bloccate con latte al 5% e incubate con anticorpi primari e quindi con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP). Le bande immunoreattive sono state visualizzate in un sistema ChemiDoc XRS + (Bio-Rad). Le analisi statistiche sono state quantificate dal software Image J (NIH). Ogni gruppo ha avuto tre esperimenti indipendenti. I significati statistici sono stati valutati dal t-test di uno studente spaiato a due code.

Microscopia elettronica a trasmissione

Late-passage (P9) CLOCK+/+ e CLOCK−/− hMSCs sono stati raccolti enzimaticamente con TrypLE (Thermo Fisher Scientific) e centrifugati a 500 × g per 5 min a temperatura ambiente. I pellet risultanti sono stati fissati con il 4% di paraformaldeide (PFA) in PBS (pH 7.4) su ghiaccio durante la notte. Le cellule sono state successivamente disidratate in una serie graduata di etanoli, permeabilizzati e incorporati in resina Lowicryl HM20. Le sezioni (200 nm) sono state ottenute e riprese con un microscopio elettronico a trasmissione spiritica (FEI Company) funzionante a 100 kV.

Colorazione di immunofluorescenza

Le cellule seminate su coprioggetti (Thermo Fisher Scientific) sono state lavate due volte con PBS. Quindi, le cellule sono state fissate con 4% PFA per 30 min, permeabilizzate con 0.4% Triton X-100 in PBS per 30 min e bloccate con 10% siero d’asino in PBS (Jackson Immuno Research) per 1 h a temperatura ambiente. Dopo il blocco, le cellule sono state incubate con anticorpi primari a 4 °C durante la notte. Successivamente, le cellule sono state lavate tre volte con PBS, incubate con anticorpi secondari a temperatura ambiente per 1 h e lavate tre volte con PBS. I nuclei sono stati colorati con Hoechst 33342 (H3570, Thermo Fisher Scientific). L’imaging è stato eseguito con un sistema confocale Leica SP5. L’analisi statistica del numero, dell’intensità e dell’area dei segnali di fluorescenza è stata quantificata dal software Image J (NIH). Le cellule sono state raccolte da tre repliche biologiche. I significati statistici sono stati valutati dal t-test di uno studente spaiato a due code. La ricostruzione 3D della colorazione H3K9me3 come mostrato in Fig. 2f è stato eseguito mediante sezionamento seriale z-stack a intervalli di 50 nm in modalità convenzionale per un massimo di 50 immagini con un sistema confocale Leica SP5 ed ulteriormente elaborato per la ricostruzione 3D dal software Imaris (versione 7.4.2) come descritto in precedenza.90

Saggio di colorazione SA-β-gal

La colorazione SA-β-gal è stata eseguita come descritto in studi precedenti.33,34 In breve, le cellule sono state fissate con tampone di fissazione (2% formaldeide e 0.2% glutaraldeide) per 5 min a temperatura ambiente. Quindi, le cellule fisse sono state macchiate con una soluzione di colorazione fresca a 37 °C durante la notte. I campi di vista sono stati selezionati casualmente in ciascun pozzetto e la percentuale di cellule SA-β-gal-positive è stata determinata utilizzando il software ImageJ. Ogni gruppo aveva tre repliche biologiche. I significati statistici sono stati valutati dal t-test di uno studente spaiato a due code.

Test di espansione clonale

È stato condotto un test di espansione clonale come riportato in precedenza.34,65 In breve, 6000 cellule per pozzo sono state seminate in piastre a 6 pozzetti e coltivate per 9-12 giorni. Le celle sono state lavate due volte con PBS, fissate con 4% PFA e colorate con 0,2% di viola di cristallo per 1 h a temperatura ambiente. I campi di vista sono stati scansionati da uno scanner e ulteriormente misurati dal software ImageJ (NIH). Ogni gruppo aveva tre repliche biologiche. I significati statistici sono stati valutati dal t-test di uno studente spaiato a due code.

Co-IP

Le cellule HEK293T trasfettate con plasmidi che esprimono Flag-Luc o Flag-CLOCK e HMSC sono state lisate in CHAPS lysis buffer (120 mm NaCl, 0.3% SCREPOLATURE, 1 mm EDTA, 40 mm HEPES (pH 7,5) e cocktail inibitore della proteasi completo (Roche)) a 4 °C per 4 h e sono stati quindi centrifugati a 14.500 × g a 4 °C per 40 min. Per il Co-IP con esogeno proteine, i supernatanti sono stati mescolati con anti-Flag anticorpi accoppiati perline (A2220, Sigma) e ruotato durante la notte a 4 °C. Per la Co-IP con proteine endogene, i supernatanti sono stati mescolati con indicato anticorpi durante la notte a 4 °C con rotazione e sono stati poi incubati con Proteina A/G-PLUS perline Agarosio (sc-2003, Santa Cruz) per altri 4 h a 4 °C con rotazione. Le perle sono stati lavati sei volte con CHAPS buffer e poi eluiti con peptidi bandiera o bollendo in 1× SDS buffer di carico per 10 min per western blotting.

LC-MS/MS analysis and protein identification

Le proteine eluite ottenute mediante immunoprecipitazione sono state sottoposte al 10% di SDS-PAGE e colorate con Coomassie brilliant blue (WB-0101, Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co. Ltd). Le bande di gel contenenti i campioni di proteine sono state asportate, tagliate in piccoli tappi, disidratate (100% acetonitrile), ridotte (10 mm DTT in 25 mM NH4HCO3 per 45 min a 56 °C) e alchilate (40 mM iodoacetamide in 25 mM NH4HCO3 per 45 min a temperatura ambiente al buio). Successivamente, i tappi di gel sono stati essiccati e digeriti con tripsina modificata di grado sequenziale (40 ng per banda) in 25 mm NH4HCO3 durante la notte a 37 °C. Infine, l’acido formico ad una concentrazione finale dell ‘ 1% è stato utilizzato per terminare la reazione enzimatica. La soluzione risultante è stata quindi trasferita in un flaconcino campione per l’analisi LC-MS/MS.

Gli esperimenti nanoLC-MS/MS sono stati eseguiti su uno spettrometro di massa Q Exactive (Thermo Scientific) in modalità dipendente dai dati, che ha permesso l’acquisizione dei dati MS ad un’alta risoluzione di 70.000 (m/z 200) in un intervallo m/z di 300-1.600. I dati grezzi di Q Exactive Analysis sono stati analizzati con Proteome Discovery (versione 1.4) utilizzando il motore di ricerca Sequest HT per l’identificazione delle proteine e il percolatore per l’analisi false discovery rate (FDR). I dati sono stati ricercati contro il database delle proteine umane UniProt (aggiornato su 06-2013). L’analisi FDR è stata eseguita con Percolatore e FDR < 1% è stata impostata come soglia per l’identificazione delle proteine. La fiducia del peptide è stata impostata su alta per il filtraggio del peptide.

RT-qPCR e RNA-Seq

L’RNA totale è stato estratto da cellule umane coltivate o articolazioni di topo utilizzando TRIzol (Thermo Fisher Scientific) e il DNA genomico è stato rimosso utilizzando un kit privo di DNA (Thermo Fisher Scientific). cDNA è stato generato con il Go Script Reverse Transcription System (Promega). RT-qPCR è stato eseguito utilizzando qPCR Mix (Toyobo) in un sistema in tempo reale CFX384 (Bio-Rad). Ogni gruppo aveva quattro ben replicati. I significati statistici sono stati valutati dal t-test di uno studente spaiato a due code. Tutti gli esperimenti RT-qPCR sono stati eseguiti con almeno tre repliche sperimentali e ripetuti indipendentemente per almeno due volte. Per l’RNA articolare del mouse-seq, i campioni di RNA articolare del ginocchio dello stesso gruppo di trattamento di topi invecchiati iniettati con lentivirus che esprimono Luc (n = 12 topi) o CLOCK (n = 12 topi) sono stati mescolati ugualmente in massa e l’RNA-seq è stato eseguito con due repliche tecniche. Per hMSC RNA-seq, sono state esaminate due repliche biologiche. Una libreria di sequenziamento è stata costruita utilizzando un NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit per Illumina seguendo il protocollo del produttore. Le librerie generate sono state sequenziate su piattaforme Illumina HiSeq X-Ten con sequenziamento accoppiato con lunghezze di lettura di 150 bp. Il controllo di qualità e il sequenziamento sono stati eseguiti dalla tecnologia NOVO gene Bioinformatics. I primer utilizzati per qPCR sono stati mostrati nelle informazioni supplementari, Tabella S2.

Elaborazione dati RNA-seq

La pipeline di elaborazione dati RNA-seq è stata segnalata in precedenza.34 Raw accoppiati-end letture sono stati tagliati in Trim Galore software (versione 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Le letture pulite sono state mappate sul genoma umano UCSC hg19 o sul genoma mm10 del mouse utilizzando hisat2 (versione 2.0.4).91 I file sam sono stati convertiti in file bam da SAMtools con il parametro “- S-b-q 10”.92 Quindi, i conteggi di lettura sono stati calcolati da HTSeq (versione 0.11.0) e sono state mantenute solo letture mappate di alta qualità (mapping quality > 20).93 Il valore dei frammenti per Kilobasi per milione (FPKM) per ciascun gene è stato calcolato utilizzando StringTie (versione 1.2.3).94 geni espressi in modo differenziale (DEGs) sono stati calcolati utilizzando il pacchetto DESeq2 (versione 1.22.2) con il cutoff “valore q (valore p regolato, padj) < 0,05 e |log2 (fold change)| > 1 per hMSCs o |log2 (fold change)| > 0,5 per le articolazioni del mouse”. Gene Ontology (GO) analisi di arricchimento è stata condotta con ToppGene.L’analisi di arricchimento del set genetico 95 è stata condotta da GSEA (versione 2.2.4). Il set di geni SASP è stato ottenuto da uno studio precedente.42

DamID-seq

pLgw V5-EcoDam e pLgw EcoDam-V5-EMD sono stati regali dal Prof. Bas van Steensel (Istituto olandese per il Cancro (NKI)). DamID-seq è stato eseguito come descritto, 58 con modifiche. In breve, i lentivirus Dam e Dam-EMD generati dalle cellule HEK293T sono stati concentrati per ultracentrifugazione a 19.400× g per 2,5 h. I pellet virali sono stati risospesi in PBS. CLOCK + / + e CLOCK− / − hMSCs sono stati seminati in piatti a sei pozzetti a 2 × 105 celle per pozzetto. Ogni gruppo aveva tre repliche biologiche. Il giorno successivo, il terreno di coltura è stato sostituito con 2 ml di terreno di coltura fresco contenente Dam o Dam-EMD lentivirus. A 72 h dopo la trasduzione, le cellule sono state raccolte e il DNA genomico è stato isolato utilizzando un kit di tessuti DNeasy Blood & (69504, Qiagen). DPNI (R0176S, New England Biolabs) digestione, legatura adattatore, DPNII (R0543S, New England Biolabs) digestione, amplificazione PCR e purificazione sono stati eseguiti come precedentemente descritto.58 Per il taglio dell’adattatore, il DNA amplificato è stato sonicato e digerito con AlwI (R0513S, New England Biolabs). La biblioteca del DNA è stata costruita utilizzando un kit NEBNext Ultra DNA Library Prep per Illumina (E7370S, New England Biolabs). Le librerie sono state raggruppate e sottoposte a sequenziamento accoppiato con lunghezze di lettura di 150 bp sui sequenziatori Illumina NovaSeq.

Elaborazione dei dati DamID-seq

Le letture grezze dei dati Dam e Dam-EMD per CLOCK+/+ e CLOCK−/− HMSC sono state tagliate nel software Trim Galore (versione 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Le letture tagliate sono state mappate sul genoma umano UCSC hg19 utilizzando Bowtie 2 (versione 2.2.9).96 duplicati PCR sono stati rimossi con i MarkDuplicates.programma jar in strumenti Picard. Quindi, le letture sono state ordinate con SAMtools (versione 1.6). Per ridurre al minimo l’effetto del bias e della profondità del sequenziamento, le letture elaborate da tre repliche per ciascun campione sono state unite. Quindi, lo stesso numero (110 milioni) di letture di alta qualità per ogni tipo di cella è stato selezionato casualmente per l’analisi a valle. Per visualizzare i segnali DamID, abbiamo calcolato il rapporto log2 delle letture per Kilobase per milione di letture mappate (RPKM) dei segnali Dam-EMD e Dam (log2 (Dam-EMD/Dam)) in CLOCK+/+ e CLOCK−/− HMSC per ogni bin 10-bp utilizzando il programma bamCompare in deepTools (versione 2.5.4-2-5ee467f) software.

Per l’identificazione delle regioni LAD in CLOCK+/+ e CLOCK−/− HMSC, abbiamo prima calcolato i segnali DamID (rapporto log2 del RPKM dei segnali Dam-EMD e Dam (log2 (Dam-EMD/Dam)) in CLOCK+/+ e CLOCK−/− HMSC per ogni bin da 2 kb utilizzando il programma bamCompare in deepTools (versione 2.5.4-2-5ee467f) software. Quindi, abbiamo implementato il pacchetto R per i modelli Markov nascosti con emissioni t (HMMt) (versione 0.1), per identificare i ragazzi (https://github.com/dinovski/asDamID/blob/master/scripts/hmmt_functions.R).

Per confrontare i segnali DamID nelle regioni LAD tra CLOCK+/+ e CLOCK−/− hMSCs, abbiamo unito le regioni LAD identificate in CLOCK+/+ e CLOCK−/− hMSCs in quelle union e calcolato il relativo segnale DamID (segnale DamID in CLOCK−/− hMSCs meno segnale DamID in CLOCK+/+ hMSCs) per ogni regione union LAD. Quindi, i relativi segnali DamID per le regioni LAD sono stati tracciati utilizzando R package RIdeogram (versione 0.2.2), come mostrato in Informazioni supplementari, Fig. S4d.97

ChIP-qPCR e ChIP-seq

In breve, 1 × 106 CLOCK+/+ e CLOCK−/− HMSC sono stati reticolati in formaldeide all ‘ 1% (vol/vol) in PBS per 8 min a temperatura ambiente e la reazione è stata terminata mediante incubazione con glicina 125 mm per 5 min a temperatura ambiente. I campioni sono stati poi lisati sul ghiaccio per un altro 10 min. Dopo sonicazione in Covaris S220 focused-ultrasonicator (Covaris) e centrifugazione per 10 min a 12.000 × g a 4 °C, i supernatanti sono stati incubati durante la notte a 4 °C con proteina A Dynabeads (Thermo Fisher Scientific, 10004D) coniugati con un anticorpo anti-CLOCK, un anticorpo anti-H3K9me3 o IgG di coniglio. Successivamente, l’eluizione e la reticolazione inversa sono state eseguite a 68 °C per 2 h in un bimby. Quindi, il DNA è stato isolato tramite estrazione di alcool fenolo-cloroformio-isoamilico e precipitazione di etanolo. Il DNA purificato è stato sottoposto a qPCR per la valutazione dell’occupazione di CLOCK o H3K9me3 a sequenze ripetitive. I frammenti arricchiti sono stati costruiti in librerie senza l’incorporazione di controlli spike-in tramite KAPA Hyper Prep Kit con PCR Library Amplification / Illumina Series (KK8504, New England Biolabs) seguendo le istruzioni del produttore. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti almeno due volte con risultati simili. I significati statistici sono stati valutati dal t-test di uno studente spaiato a due code.

Elaborazione dei dati Chip-seq

Per l’elaborazione dei dati ChIP-seq H3K9me3, le letture grezze sono state tagliate con il software Trim Galore (versione 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Le letture tagliate sono state mappate sul genoma umano UCSC hg19 utilizzando Bowtie 2 (versione 2.2.9).96 Letture duplicate sono state rimosse con i MarkDuplicates.programma jar in strumenti Picard. Quindi, le letture sono state ordinate con SAMtools (versione 1.6). Per ridurre al minimo l’effetto del bias e della profondità del sequenziamento, le letture elaborate da tre repliche per ciascun campione sono state unite. Quindi, lo stesso numero (130 milioni) di letture di alta qualità per ogni tipo di cella è stato selezionato casualmente per l’analisi a valle. Per visualizzare i segnali CHIP-seq, abbiamo calcolato i conteggi di lettura normalizzati determinando i valori RPKM per ogni bin 10-bp. Per le chiamate di picco H3K9me3, SICER (versione V1.1) è stato utilizzato con il parametro “-w 200-g 3”.98 Solo chiamato picchi H3K9me3 con un cutoff FDR di 1% o superiore sono stati mantenuti.

Per l’identificazione di “montagne H3K9me3”, è stato calcolato il segnale H3K9me3 in conteggi per milione (CPM) in ogni picco H3K9me3. Abbiamo quindi classificato i picchi H3K9me3 nell’ordine di aumentare il segnale H3K9me3 e tracciato l’occupazione del CHIP H3K9me3-seq in CLOCK + / + e CLOCK− / − HMSC, come mostrato nelle informazioni supplementari, Fig. S4f. Questi grafici hanno mostrato un chiaro punto in cui il segnale di occupazione H3K9me3 ha iniziato ad aumentare rapidamente. Quindi, sono stati determinati i punti di flesso di queste curve. Abbiamo inoltre definito i picchi H3K9me3 al di sopra dei punti di inflessione come “montagne H3K9me3” e i picchi H3K9me3 al di sotto di tali punti come picchi tipici H3K9me3.

ATAC-seq

ATAC-seq è stato eseguito come descritto in precedenza.99 In breve, un totale di 50.000 cellule sono state lavate due volte con PBS e risospese in 50 µL di tampone di lisi (10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mm NaCl, 3 mM MgCl2, 0,1% (v/v) Nonidet P40 sostituto). La sospensione dei nuclei è stata quindi centrifugata a 500 × g per 10 min a 4 °C, seguita dall’aggiunta di 50 µL di miscela di reazione di trasposizione (10 µL di tampone 5 × TTBL, 4 µL di miscela TTE e 36 µL di H2O privo di nucleasi) da un kit di preparazione della libreria di DNA TruePrep V2 per Illumina (Vazyme Biotech). I campioni sono stati quindi incubati a 37 °C per 30 min. Le librerie sono state poi amplificate e purificate utilizzando il TruePrep DNA Library Prep Kit V2 per Illumina (Vazyme Biotech). La qualità della libreria è stata valutata utilizzando un analizzatore di frammenti. Infine, le librerie sono state sequenziate su Illumina Hiseq X-Ten piattaforme con accoppiati-end sequenziamento con 150-bp leggere lunghezze.

Elaborazione dei dati ATAC-seq

Per l’elaborazione dei dati ATAC-seq, le letture grezze sono state tagliate con il software Trim Galore (versione 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Le letture tagliate sono state mappate sul genoma umano UCSC hg19 utilizzando Bowtie 2 (versione 2.2.9) con il parametro “- X 2000-N 1-L 25-no –mixed-no-discordant-t”.96 Letture duplicate sono state rimosse con i MarkDuplicates.programma jar in strumenti Picard. Quindi, le letture sono state ordinate con il software SAMtools (versione 1.6). Quindi, le letture elaborate da tre repliche per ogni campione sono state unite. Per visualizzare i segnali ATAC, abbiamo esteso ogni lettura di 250 bp e normalizzato i conteggi di lettura per il valore RPKM per ogni bin da 10 bp. Per ATAC peak calling, MACS2 (versione 2.1.1.20160309) è stato utilizzato con il parametro “–nomodel –shift 0 –extsize 250 –call-summits”.Sono stati mantenuti solo 100 picchi ATAC con valori q < 0,01. I picchi ATAC identificati in CLOCK + / + ma non in CLOCK – / – HMSC sono stati definiti come picchi ATAC “Chiusi”; i picchi ATAC identificati in CLOCK – / – ma non in CLOCK+ / + HMSC sono stati definiti come picchi ATAC “Aperti”. Stima della distribuzione genomica dei picchi ATAC utilizzati annotatePeaks.pl programma nel software homer.101

Valutazione della riproducibilità dei dati di sequenziamento

Per valutare la riproducibilità dei dati H3K9me3 ChIP-seq e ATAC-seq, la distanza euclidea tra le repliche è stata calcolata come segue: le letture sono state contate e normalizzate dall’RPKM con una dimensione bin di 2 kb. Quindi, la distanza euclidea è stata calcolata in R (versione 3.5.1) per valutare la riproducibilità. Distanze euclidee inferiori significano correlazioni più elevate. Per valutare la riproducibilità dei dati DamID-seq, l’analisi dei componenti principali (PCA) è stata condotta in R (versione 3.5.1). Per valutare la riproducibilità dei dati RNA-seq, i grafici a dispersione sono stati disegnati in base al logaritmo regolarizzato (rlog) – conteggio di lettura normalizzato con DESeq2 e il coefficiente di correlazione di Pearson tra le repliche è stato calcolato.

Esperimenti sugli animali

Per l’analisi della formazione di teratoma, topi NOD / SCID (6-8 settimane, acquistati da Beijing Vital River Laboratory Animal Technologies Co. Ltd) sono stati iniettati con 3 × 106 CLOCK + / + o CLOCK− / − hESCs in una soluzione Matrigel: mTeSR (1: 4). I teratomi sono stati raccolti 8-12 settimane dopo l’iniezione per ulteriori analisi.

Per i test di trapianto hMSC, 1 × 106 CLOCK+/+ o CLOCK−/− HMSC trasdotti con lentivirus che esprimono Luc sono stati iniettati nel muscolo TA di topi nudi (6-8 settimane). I topi sono stati quindi trattati con D-luciferina (LUCK-1G, GoldBio) e fotografati con un sistema di imaging dello spettro IVIS (Xenogen, Caliper, Waltham, MA, USA). Le immagini di bioluminescenza sono state acquisite in modalità “auto”. Ogni gruppo aveva sei repliche biologiche. I significati statistici sono stati valutati dal t-test di uno studente spaiato a due code.

Per il rilevamento del livello di clock associato all’invecchiamento, topi di età diverse (giovani, 1 mese, n = 5 topi; vecchi, 15 mesi, n = 10 topi) sono stati eutanasia e le articolazioni sono state raccolte per l’analisi RT-qPCR. I significati statistici sono stati valutati dal t-test di uno studente spaiato a due code.

Per valutare se la somministrazione lentivirale di CLOCK potrebbe alleviare le sindromi legate all’invecchiamento, i lentivirus che esprimono Luc (n = 14 topi) o CLOCK (n = 13 topi) sono stati iniettati nelle cavità articolari di topi di 18 mesi (acquistati da SPF (Beijing) Biotechnology) e reintegrati dopo 8 settimane di iniezione. L’esperimento del tapis roulant è stato condotto al momento di 15 settimane dopo la prima iniezione di lentivirus che esprimono Luc o CLOCK. In dettaglio, i topi sono stati addestrati su un tapis roulant (SA101, SANS) con una pendenza di 5° in 3 giorni per 20 min ogni giorno, con la velocità accelerata da 0 a 20 m/min. Il giorno del test, i topi correvano sul tapis roulant con una velocità iniziale di 0 m/min, quindi la velocità è stata aumentata di 2 m/min a 20 m / min. L’intero tempo di esecuzione è stato impostato su 20 min. La frequenza dello stimolo di scossa elettrica lieve è stata registrata e analizzata (Luc, n = 14 topi; OROLOGIO, n = 13 topi). La scansione micro-CT è stata eseguita al tempo di 16 settimane dopo la prima iniezione (Luc, n = 14 topi; OROLOGIO, n = 13 topi). I topi sono stati quindi sottoposti a eutanasia e le articolazioni sono state raccolte per la valutazione istologica (Luc, n = 14 topi; OROLOGIO, n = 13 topi) e la quantificazione dell’mRNA (Luc, n = 12 topi; OROLOGIO, n = 12 topi). I significati statistici sono stati valutati dal t-test di uno studente spaiato a due code.

Istologia e immunoistochimica

Per l’analisi istologica, le articolazioni del topo raccolte sono state fissate con PFA al 4% per 2 giorni e incorporate in paraffina dopo decalcificazione per 14-21 giorni. Le sezioni (5 µm) sono state colorate con FCF verde veloce (0,02%) e safranina O (0.1%) secondo le istruzioni del produttore.

La colorazione immunoistochimica è stata eseguita utilizzando il metodo di colorazione DAB come descritto in precedenza, con alcune modifiche.33,34,102 In primo luogo, i vetrini sono stati deparaffinizzati e reidratati usando xilene e diverse concentrazioni di alcol. Il recupero dell’antigene è stato eseguito utilizzando la digestione tripsina (ZLI-9010, ZSGB-BIO) per 20 min a temperatura ambiente. Il perossido di idrogeno (3%) è stato utilizzato per bloccare l’attività endogena della perossidasi incubando per 10 min a temperatura ambiente. I vetrini sono stati quindi bloccati con siero d’asino al 10% per 1 ora a temperatura ambiente e incubati con un anticorpo anti-P16 (Ab54210, Abcam, 1:200) a 4 °C durante la notte e con un anticorpo secondario (PV-6002, ZSGB-BIO) per 1 ora a temperatura ambiente prima della colorazione DAB (ZLI-9017, ZSGB-BIO).

Dichiarazioni etiche

Gli esperimenti coinvolti in questo studio hanno seguito i principi per il formato di applicazione per l’approvazione etica per la ricerca che coinvolge gli animali e sono stati approvati in anticipo dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali dell’Istituto di Zoologia (Accademia cinese delle Scienze). L’anestesia dei topi è stata condotta con isoflurano e l’eutanasia è stata eseguita con CO2 seguita da dislocazione cervicale.

Analisi statistica

Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software Prism Graph-Pad. I dati sono presentati come mezzi ± SEM o SD. I confronti sono stati eseguiti con t-test dello studente spaiato a due code. Il valore P (p) < 0,05 è stato definito statisticamente significativo.