Trasformazione del clordecone pesticida recalcitrante da parte di Desulfovibrio sp.86 con un passaggio dalla declorazione ad apertura ad anello all'attività di solfidazione riduttiva / Rapporti scientifici

Isolamento di Desulfovibrio sp.86
Analisi del genoma di Desulfovibrio sp.86
Desulfovibrio sp.86 degrada il clordecone in prodotti di trasformazione noti e un composto contenente zolfo inaspettato
Sintesi dello standard clordectiolo e conferma che il prodotto di trasformazione F1 è identico al clordectiolo
La capacità di Desulfovibrio sp.86 per degradare i prodotti di trasformazione del clordecone
Studio delle condizioni di incubazione che portano alla solfidazione riduttiva batterica
Rilevanza ambientale della solfurazione riduttiva del clordecone

Isolamento di Desulfovibrio sp.86

Isolamento di Desulfovibrio sp.86 è stato ottenuto dal consorzio di degradazione del clordecone 865 utilizzando condizioni di riduzione del solfato. Poiché il consorzio batterico 86, in grado di trasformare il clordecone, è stato ottenuto da un mezzo minerale arricchito (MM) denominato MM + 5, integrato con clordecone, la composizione chimica principale è stata mantenuta ma i donatori di elettroni e gli accettori sono stati modificati. Diverse formulazioni di media utilizzate per arricchire i batteri che riducono il solfato utilizzano acidi organici, ad esempio lattato,come fonti di carbonio ed energia (donatore di elettroni) e solfato che viene utilizzato come accettore di eletron per la crescita15,16,17, 18. In questo contesto, il piruvato nel mezzo liquido MM + è stato sostituito da lattato e solfato è stato aggiunto (mezzo liquido MMD, vedere la sezione “Metodi”). L’arricchimento è stato diffuso su agar MMD e le colonie batteriche brune vibrio-simili (osservate al microscopio ottico) sono state ulteriormente purificate attraverso due ulteriori streakings di piastre (Fig. S1). Un ceppo batterico isolato è risultato essere identico a Desulfovibrio sp.86 dal consorzio 86 basato su identità 100% dei loro geni 16S rRNA (1538 bp ciascuno).

Analisi del genoma di Desulfovibrio sp.86

L’intero genoma è costituito da un singolo cromosoma circolare 3.464.070 bp. L’analisi checkm19 eseguita con 61 genomi e 284 lignaggi indica che il genoma appartiene ai Deltaproteobatteri e la completezza CheckM è del 100% (zero marker essenziale mancante). Il contenuto medio di G + C per il DNA è del 58,06%. Un totale di 3.342 sequenze di DNA codificanti (CDSS) sono state previste per il cromosoma, 4 pseudogeni e 10 RNA vari (misc-RNA), 3 operoni rRNA e 54 geni tRNA.

I tre geni 16S rRNA di Desulfovibrio sp.86 sono identici. I loro migliori colpi di ESPLOSIONE (NCBI) provenivano da Desulfovibrio sp incolto. cloni da celle a combustibile microbiche come MFC63A04 (numero di adesione Genbank : FJ823865; copertura 98%; identità 99,87%)20. Un albero filogenetico che utilizza il rRNA 16S disponibile di batteri coltivabili ha confermato le somiglianze tra Desulfovibrio sp.86 e Desulfovibrio simplex DSM4141 (Genbank 16S rRNA numero di adesione: NR_117110; copertura 99%; identità 99, 22%; sequenza genomica non disponibile) (Fig. S2) 21. A livello genomico, Desulfovibrio sp.86 al primo posto con Desulfovibrio desulfuricans subsp. desulfuricans str. ATCC 27.774 genoma (GenBank:NC_011883). Tuttavia, Desulfovibrio sp.86 condivide solo i geni 1,408 (43%) con D. desulfuricans (oltre l’identità degli amminoacidi 80% e la copertura dell’allineamento 80%). Inoltre, le identità nucleotidiche medie (ANI) tra Desulfovibrio sp.86 e i genomi di Desulfovibrio sequenziati sono inferiori al valore di cut-off ANI del 95% generalmente accettato per la delineazione delle specie (Fig. S3) 22. Questi risultati indicano che Desulfovibrio sp.86 è molto probabilmente una nuova specie del phylum Desulfovibrio. La presenza di due superossido dismutasi e un gene catalasi rappresenta la relativa tolleranza all’ossigeno. Come previsto, il Desulfovibrio sp.86 genoma presenta un ampio gene complemento per il metabolismo dello zolfo, che comprende le vie di respirazione di zolfo con fonti inorganiche come solfato, solfito, bisolfito e tetrationato come accettori di elettroni. Le fonti organiche dello zolfo possono essere fornite dai prodotti di fermentazione della biomassa dello zolfo (sulfochinovose dei lipidi del sulfochinovosyl) sulfoacetate, la taurina dell’aminoacido non proteogenic dello zolfo via sulfoacetaldehyde, o alcanesulfonates23.

Desulfovibrio sp.86 degrada il clordecone in prodotti di trasformazione noti e un composto contenente zolfo inaspettato

La capacità di degradazione del clordecone del Desulfovibrio sp isolato.86 ceppo è stato studiato utilizzando tecniche GC–MS (Gascromatografia Mass Spectrometry) e LC-HRMS (Liquid Chromatography High Resolution Mass Spectrometry) in condizioni di crescita applicate con successo per Desulfovibrio sp.86 isolamento (MMD liquido medio). Na2S è stato utilizzato come riducente e un’atmosfera anaerobica N2/H2 (98/2; V/V) è stata applicata utilizzando un sistema di vano portaoggetti. Queste condizioni di incubazione hanno portato alla completa scomparsa del segnale clordecone in GC-MS e LC–HRMS e hanno portato a profili GC-MS e LC-HRMS TP simili a quelli ottenuti con Citrobacter sp.866: monoidroclordecone A1, pentacloroindene B1, tetracloroindeni B3-B4 e acidi policloroindenecarbossilici C1-C2 e C3-C4 (Fig. 1 bis, lettera b). Nel sistema del vano portaoggetti, le colture batteriche sono state eseguite utilizzando fiale di vetro da 100 ml con un film poroso idrofobo per consentire lo scambio di gas ed evitare la contaminazione. Questa condizione di incubazione è stata considerata come condizione di” atmosfera rinnovata ” (RA). In questo sistema, l’atmosfera è stata regolarmente rinnovata con N2 / H2 (98/2; V/V) e la scatola non è stata controllata termostaticamente, quindi la temperatura varia tra 25 e 33 °C. Per controllare meglio le condizioni di crescita e degradazione, Desulfovibrio sp.86 colture sono state poste in mezzo MMD utilizzando flaconcini di vetro da 100 mL, sigillati con setti di gomma butilica, in un forno a 30 °C. I flaconcini sigillati sono stati inizialmente spurgati con gas N2/H2 (98/2; V/V) per assicurare l’anaerobiosi. Questa condizione di incubazione è stata considerata come condizioni di” atmosfera confinata ” (CA).

Dopo sei settimane di incubazione con clordecone, il pesticida non era più rilevabile con le stesse tecniche analitiche. Contemporaneamente, è apparso un singolo composto clorurato sconosciuto chiamato F1. Era rilevabile solo attraverso GC-MS (25,6 min) (Fig. 1c). Come nelle colture di degradazione dei clordeconi precedentemente segnalate5, 6, la principale trasformazione dei clordeconi è comparsa durante la fase stazionaria (Fig. 1e). Poiché nessun picco clorurato visibile potrebbe essere osservato in LC-HRMS (Fig. 1d), abbiamo basato la delucidazione strutturale di F1 sull’interpretazione dei dati GC–MS (Fig. 1f). Supponendo che il modello isotopico più alto centrato a m/z 507.8 contenesse lo ion molecolare, abbiamo ipotizzato due possibili formule neutre per F1, C10Cl10O2H2 e C10Cl10SH2. I frammenti in-source erano molto simili a quelli osservati in strutture a base di bishomocubane policlorurati tra cui clordecone, idroclordeconi, clordecolo e mirex5,6,24. Infatti, i modelli isotopici a m / z 201.0, 235.9 e 271.9 presumibilmente è sorto dalla nota retrociclodimerizzazione di bishomocubane in-source e corrispondeva a frammenti C5 caricati positivamente. Il confronto con simulazioni isotopiche ha limitato la possibilità ai seguenti ioni radicali: + · + · e+*, con n = 0,1. Quest’ultima formula generica bis-ossigenata si è rivelata altamente improbabile poiché richiedeva la presenza di una funzione gem-diol o di una frazione gem-cloroidrina sull’anello ciclopentenilico che doveva resistere alle dure condizioni cromatografiche GC (> 200 °C). Invece, abbiamo concluso che una frazione di zolfo, cioè. una funzione di tiolo, era probabilmente presente sul policiclo bishomocubane. Abbiamo proposto per F1 la struttura raffigurata in Fig. 2a e ha suggerito il nome chlordecthiol, l’analogo dello zolfo di chlordecol (alcool di chlordecone).

Sintesi dello standard clordectiolo e conferma che il prodotto di trasformazione F1 è identico al clordectiolo

Per confermare la struttura di F1, il clordectiolo standard è stato sintetizzato chimicamente e completamente caratterizzato. Per ottenere la solfidazione riduttiva chimica del clordecone, erano necessari due passaggi. Il primo consisteva nella conversione della funzione gem-diolo del clordecone in equilibrio con la corrispondente forma chetonica 20,25 nell’analogo dello zolfo, cioè la frazione gem-tiolo/tiocarbonile. Per eseguire questo passaggio, vengono generalmente applicati reagenti contenenti zolfo fosforosi26, 27. Qui abbiamo usato decasolfuro di fosforo (P4S10)chiamato anche reagente di Berzelio27, 28 secondo il protocollo di Zaidi e colleghi che hanno sintetizzato con successo canforthiol29 (Fig. 2 bis). Il secondo passo consisteva nella riduzione dell’intermedio gem-tiolo utilizzando NaBH4. Dopo la purificazione, è stato ottenuto un solido bianco in una resa complessiva del 73% (Fig. 2 bis). 1D e 2D NMR analisi ha confermato la chlordecthiol struttura: (i) due segnali 1H integrazione di ciascuno per un protone e accoppiati (δ 3.78 ppm, d, J = 5.5 Hz e δ 2.01 ppm, d, J = 5.5 Hz), con l’uno a δ 3.78 ppm correlato a un 13C segnale spostato downfield (δ 55.1 ppm) in HSQC esperimento perfettamente conto per il CH frazione avanti per il tiolo funzione e (ii) un totale di sei visibile 13C segnali che riflettono il piano di simmetria, conservato nel presente bishomocubane struttura (Fig. 2a, Fichi. S19–23). Sebbene nella trasformazione microbica, F1 non possa essere rilevato utilizzando lo strumento LC-HRMS nelle condizioni sviluppate, un campione concentrato del clordectiolo standard sintetico ha fornito un segnale significativo. La presenza di un atomo di zolfo e la formula neutra prevista C10Cl10SH2 sono state confermate (Fig. 2c, d) e le formule grezze C10Cl10O2H2 sono state escluse (Fig. 2 ter). Infine, l’analisi GC-MS ha dimostrato la corrispondenza perfetta (cioè lo stesso tempo di ritenzione di 25,6 min e gli stessi spettri di massa in-source Fig. S6) tra lo standard sintetico e TP F1, assegnandolo quindi definitivamente come clordectiolo. Infatti, F1 rappresenta il primo membro di una nuova famiglia di clordecone TPS che possiede per la prima volta un atomo di zolfo.

La capacità di Desulfovibrio sp.86 per degradare i prodotti di trasformazione del clordecone

Composti A1, B1, C1-C2 e F1 rappresentativi delle quattro famiglie di TPS eventualmente formate in presenza di Desulfovibrio sp.86 sono stati sintetizzati secondo protocolli chimici precedentemente segnalati6 e qui sviluppati per F1. Ciascuno di essi è stato incubato in presenza di Desulfovibrio sp.86 colture in condizioni che hanno dimostrato di promuovere la solfidazione riduttiva (flaconcino sigillato; condizioni CA) o la declorazione con apertura ad anello (flaconcino aperto; condizioni RA). È stato eseguito il doppio monitoraggio GC–MS e LC-HRMS di tutti i campioni.

Dopo un mese di incubazione in condizioni di CA, il 10-monoidroclordecone A1 è stato completamente trasformato in due composti clorurati sconosciuti appena separati utilizzando GC-MS (tempi di ritenzione: 24,3 min F2 e 24,5 min F3, Fig. 3, Fichi. S7–S11). Hanno mostrato uno spettro di massa in-source identico che era molto simile al modello di frammentazione F1 (Fig. S8). Tutti i frammenti in-source rilevati si sono rivolti a possedere un atomo di cloro in meno rispetto ai loro analoghi nello spettro di massa F1. I composti F2 e F3 sono stati quindi assunti come diastereoisomeri del 10-monoidroclordectiolo (Fig. 3 quater). Ciò è stato confermato dalla sintesi chimica dei due standard 10-monohydrochlordecthiol da 10-monohydrochlordecone A1 utilizzando la procedura precedentemente applicata per la sintesi di chlordecthiol F1 (Figs. S24–27). Questi standard chimici avevano gli stessi tempi di ritenzione (24,3 e 24,5 min) e gli stessi spettri di massa rispetto ai biologici F2 e F3 (Fig. S8). TPs B1, C1-C2 e F1 sono rimasti invariati anche dopo sei mesi di incubazione con Desulfovibrio sp.86 in condizioni CA.

Dopo sei mesi di incubazione in condizioni di AR, il clordectiolo F1 è stato parzialmente convertito in 10-monohydrochlordecthiols F2 e F3, e altre due specie clorurate sconosciute rilevate utilizzando GC–MS, denominate F4 (tempo di ritenzione: 17,9 min) e F5 (tempo di ritenzione: 26,6 min) (Fig. 3d, Fig. S12). Nessuno di questi due composti ha dato alcun segnale rilevabile in LC-HRMS. L’analisi GC-MS ha permesso di proporre C10Cl6SH4 come formula grezza per F4 (Fig. S14), e C11Cl10SH4 per F5 (Fig. S15). Il metil clordecsolfuro è stato sintetizzato chimicamente e completamente caratterizzato da NMR (Fig. S28-31). La perfetta corrispondenza tra i tempi di ritenzione GC e gli spettri di massa GC di metil clordecsolfuro e F5 biologico (Fig. S13) conferma la sua identità postulata. Degno di nota, la struttura di F5 (Fig. 3d) rappresenta una forma S-metilata di F1. La natura esatta di F4 rimane da chiarire (vedi SI-Testo supplementare). Tutti gli altri TPS sono rimasti invariati in condizioni di AR.

In sintesi, A1 (formato in condizioni di RA) ha subito una solfidazione riduttiva proprio come il clordecone; in entrambe le condizioni di incubazione i policloroindeni (B1 e C1-C2) non sembrano essere degradabili da Desulfovibrio sp.86, mentre F1 (prodotto in condizioni di CA) potrebbe essere trasformato in condizioni di RA (Fig. 3).

Studio delle condizioni di incubazione che portano alla solfidazione riduttiva batterica

Per interrogare i parametri fisico-chimici o fisiologici che influenzano i percorsi di trasformazione del clordecone nelle colture di Desulfovibrio sp.86, è stato scelto il monitoraggio GC–MS (presenza di B1 e F1 come evidenza di condizioni di RA e CA, rispettivamente).

Due composti inorganici contenenti zolfo, il riduttante Na2S e l’accettore di elettroni Na2SO4, erano presenti nel mezzo liquido originale MMD. Una prima serie di esperimenti in flaconcini sigillati con sostituzione di Na2S con altri agenti riducenti, solfurati o meno, cioè cisteina e citrato di titanio (III) (TiCi) ha portato a un livello comparabile di clordectiolo F1 (Tabella 1). Tracce di TP B1 sono state osservate anche in tutti gli esperimenti, incluso Na2S, il controllo positivo (Tabella 1).

Tabella 1 Influenza dell’agente riducente sul profilo del clordecone TP.

Una seconda serie di esperimenti è stata progettata utilizzando Na2S come agente riducente e accettori elettronici alternativi a base di zolfo in fiale sigillate (Tabella 2). L’uso del solfato inorganico arricchito al 90% di 34S ha prodotto un prodotto di clordectiolo che mostra un livello di arricchimento simile a 34S (90% 34S-F1/10% F1, Fig. S16). L’analisi GC-MS dello spazio di testa della cultura ha anche rivelato la presenza di H234S e H3C34SH (Fig. S16), dimostrando così che Desulfovbibrio sp.86 ha prodotto H2S dal solfato. Questi gas sono stati rilevati nello spazio di testa della coltura in condizioni CA, utilizzando il mezzo MMD, mentre erano assenti dallo spazio di testa della coltura in condizioni RA che corrispondevano all’atmosfera del vano portaoggetti (Fig. S17). L’assenza di solfato non ha inibito Desulfovibrio sp.86 crescita, tuttavia ha portato alla formazione di B1 (Tabella 2) 5. Il rimontaggio del solfato per solfito, bisolfito o tiosolfato ha portato in tutti i casi alla formazione di clordectiolo F1.

Tabella 2 Influenza dell’accettore di elettroni a base di zolfo sul profilo del clordecone TP.

Una terza serie di esperimenti con vasi ha studiato l’effetto della natura della fase gassosa a contatto con la coltura. Tra la condizione di RA che utilizza fiale aperte in vano portaoggetti e la condizione di CA che utilizza fiale sigillate in forno, diversi parametri differivano (atmosfera natura e volume, temperatura). Utilizzando un sistema jar che include diverse fiale, studiamo selettivamente l’effetto del rinnovamento dell’atmosfera sulla trasformazione del clordecone da parte di Desulfovibrio sp.86 in MMD medio. In ogni caso, le fiale aperte con film porosi idrofobi sono state poste in barattoli inizialmente spurgati con un gas selezionato. Tutti i barattoli sono stati incubati a 30 °C. Alcuni di essi sono stati lavati più volte, per imitare il sistema del vano portaoggetti, mentre altri sono stati tenuti chiusi.

I barattoli 1-4 contenevano due flaconcini aperti identici riempiti con MMD, clordecone e Desulfovibrio sp.86 inoculo e un controllo abiotico negativo. Tra questi, due vasi sono stati lavati due volte a settimana, vaso 1 con (N2 / H2 (98/2; V / V)), vaso 2 con N2 (Fig. 4a), mentre i vasi 3 e 4, inizialmente spurgati con N2 e (N2 / H2 (98/2; V / V)) rispettivamente sono stati lasciati non chiusi (Fig. 4 ter).

Gli ultimi due barattoli (vaso 5 e 6) contenevano tre flaconcini aperti riempiti con MMD, clordecone e Desulfovibrio sp.86, più una coltura senza solfato. Questi vasi sono stati inizialmente lavati con (N2 / H2 (98/2; V / V)) e lasciati non chiusi per 2 mesi (Fig. 4 quater).

In parallelo ai vasi, due fiale sigillate riempite con MMD senza solfato, clordecone e Desulfovibrio sp.86 sono stati lavati con H2S sintetizzati estemporaneamente (Fig. S4).

Dopo incubazione di due mesi a 30 °C, TP B1 è stato rilevato in flaconcini posti nei barattoli 1 e 2 sciacquati (Tabella 3a), mentre TP F1 è stato trovato solo in flaconcini posti nei barattoli 3 e 4 non chiusi (Tabella 3b). Nessun TP era presente nei controlli abiotici. Nei vasi 5 e 6, F1 era presente sia in Desulfovibrio sp solfato che senza solfato.86 colture aperte (Tabella 3c). Allo stesso modo, Desulfovibrio sp.86 colture prive di solfato, lavate con H2S hanno mostrato livelli significativi di F1 TP, mentre non è stata osservata alcuna trasformazione nel controllo negativo (Tabella 3d).

Tabella 3 Influenza dell’atmosfera gassosa sul profilo del clordecone TP.

Un ulteriore esperimento chimico è stato condotto per valutare l’influenza di H2S sulla trasformazione del clordecone. È stato applicato il classico protocollo chimico che consente la formazione di B e C TPs (clordecone, citrato di titanio, vitamina B12, acqua). In atmosfera N2 sono stati ottenuti TPS B e C, tuttavia in atmosfera H2S è stato prodotto solo A1 (Fig. S18).

Questi risultati mostrano chiaramente che la formazione di clordectiolo F1 richiede un sistema di incubazione chiuso con un’atmosfera riducente. Tuttavia H2 poiché l’atmosfera gassosa iniziale non è obbligatoria mentre è richiesta la presenza di H2S. Chimicamente, la presenza di H2S impedisce il processo di declorazione dell’apertura dell’anello.

Rilevanza ambientale della solfurazione riduttiva del clordecone

Abbiamo reinvestitato la nostra precedente raccolta di campioni ambientali contaminati dal clordecone dell’isola della Martinica (otto suoli e due sedimenti a letto) in cui erano stati segnalati vari livelli di TPS di clordecone6. Tra i nuovi TPS contenenti zolfo qui riportati, abbiamo trovato livelli apprezzabili di F1 nei due campioni di sedimenti a letto (927 e 928) ad una concentrazione stimata intorno a 50 µg/kg e 20 µg/kg di sedimenti umidi, rispettivamente (Tabella S1). In parallelo, i dati sulla diversità della popolazione batterica emessi dall’analisi del metabarcoding di questi campioni (Fig. 5, Fig. S5) sono stati elaborati per recuperare un clustering gerarchico di campioni ambientali in base alla loro composizione tassonomica6. Si è notato che i batteri che riducono il solfato erano molto più presenti nei sedimenti del letto che negli altri compartimenti,come riportato in precedenza30,31, 32.

Trasformazione del clordecone pesticida recalcitrante da parte di Desulfovibrio sp.86 con un passaggio dalla declorazione di apertura dell’anello all’attività di solfidazione riduttiva