un Minimo di Informazione per la creazione di report con il test della Cometa (MIRCA): raccomandazioni per la descrizione comet assay procedure e risultati

La MIRCA linee guida sono stati realizzati da membri di hCOMET COSTO Azione con l’obiettivo di migliorare l’analisi e la reportistica dei test della cometa risultati (http://www.hcomet.eu/). Gli autori sono esperti comet assay con un minimo di otto anni di esperienza con questi saggi (15 degli autori hanno >20 anni di esperienza pertinente). Abbiamo utilizzato un questionario basato su Internet per campionare le opinioni degli autori sull’importanza della segnalazione dei dettagli (Tabella 1; Dati supplementari). Ogni informazione è stata classificata dagli autori come “essenziale”, “desiderabile” o “non importante” e per le classificazioni è stata utilizzata una soglia di congruenza ≥75%. Se il numero di risposte “informazioni essenziali” non ha raggiunto la soglia del 75% di accordo, le risposte “informazioni essenziali” e “informazioni desiderabili” sono state combinate e l’informazione è stata classificata come “informazioni desiderabili” se ≥75% gli autori hanno convenuto che era “essenziale” o “desiderabile”. Nella tabella 1, includiamo note esplicative per ogni raccomandazione.

Raccomandazioni MIRCA specifiche per ogni fase del test comet

Fase 1A: Isolamento delle cellule e preparazione di sospensioni unicellulari

Poiché il saggio comet utilizza sospensioni di singole cellule, i campioni che non sono ottenuti come singole cellule devono essere trattati meccanicamente o enzimaticamente per interrompere l’attaccamento delle cellule a una matrice extracellulare o tra loro. L’omogeneizzazione dei tessuti mediante interruzione meccanica può causare danni al DNA, mentre la digestione enzimatica del tessuto può portare alla rimozione delle lesioni del DNA dovute all’attività degli enzimi di riparazione del DNA endogeno o aumentare i livelli di danno al DNA rilasciando nucleasi dalle cellule. La composizione del tampone di omogeneizzazione è un’informazione “desiderabile”, in particolare per quanto riguarda i componenti necessari per preservare l’integrità del DNA (ad esempio, acido etilendiamminotetraacetico)24,25. Una descrizione della procedura per l’isolamento delle sospensioni monocellulari, compresa l’omogeneizzazione del tessuto, è considerata un’informazione “auspicabile” da riportare negli articoli.

I campioni di sangue sono spesso utilizzati negli studi di biomonitoraggio umano. Poiché il sangue rappresenta una popolazione eterogenea di cellule, informazioni dettagliate sulla popolazione cellulare sono “essenziali” nelle pubblicazioni. Il testo dovrebbe descrivere con precisione se i campioni sono sangue intero (compresi i globuli rossi), leucociti, globuli mononucleati o un sottoinsieme di cellule (ad esempio, linfociti). Può anche essere utile includere informazioni sulla procedura per la venipuntura, il tipo di anticoagulante e il successivo metodo di isolamento cellulare (ad esempio, centrifugazione e fasi di lavaggio) per coloro che ripetono l’esperimento, quindi questo è classificato come informazioni “desiderabili”. Informazioni sulle condizioni di conservazione di cellule o tessuti se sono crioconservati, così come il metodo di congelamento (ad esempio, snap zero in ghiaccio secco o azoto liquido, o una lenta procedura di congelamento) e scongelamento procedura, è considerato “essenziale” informazioni per segnalare, come questi processi hanno dimostrato di influenzare il livello basale di DNA migration26.

Punto 1B: Preparazione di cellule substrato per il test di riparazione del DNA in vitro

Qualsiasi tipo di cellula eucariotica può essere utilizzata come cellula substrato per il test di riparazione del DNA in vitro e il tipo di cellula e la densità sono informazioni “desiderabili” da riportare. È “essenziale” riportare il metodo e il tipo di composto genotossico utilizzato per indurre lesioni al DNA nelle cellule del substrato e le successive condizioni di conservazione delle cellule, mentre il livello totale di lesioni al DNA che possono essere rilevate nelle cellule del substrato (ad es., il numero di siti sensibili alla formamidopirimidina DNA glicosilasi nelle cellule trattate con Ro19-8022 più luce) è considerato solo un’informazione “desiderabile”.

Fase 1C: Controlli di dosaggio

In questo articolo, i controlli di dosaggio si riferiscono a campioni inclusi in ogni esperimento di saggio comet; questi sono talvolta chiamati standard di riferimento, controlli interni o controlli tecnici16,27. I controlli del test sono tipicamente aliquote crioconservate da un singolo lotto di cellule che sono state esposte a un agente di rottura del filamento di DNA (ad es., radiazioni ionizzanti, perossido di idrogeno o metil metansolfonato) o un trattamento che provoca un tipo specifico di lesione del DNA (ad esempio, il fotosensibilizzatore Ro19-8022 più luce, o trattamento con bromato di potassio, per indurre l’ossidazione del DNA). Esistono diversi controlli di dosaggio per il test standard di cometa alcalina e il test di cometa modificato dall’enzima. Il composto utilizzato per il test modificato dall’enzima non deve generare rotture del filamento di DNA, poiché queste riducono la gamma dinamica dei siti sensibili all’enzima. Negli studi di biomonitoraggio, così come negli studi trasversali, interventistici e clinici, le cellule non esposte possono essere utilizzate come controlli di analisi. È “essenziale” riportare i livelli di danno nei controlli del saggio e la variazione del saggio (deviazione standard) sia nel saggio standard che nel saggio comet modificato dall’enzima.

Il test di riparazione del DNA in vitro utilizza controlli sperimentali interni, che vengono utilizzati anche nel calcolo dell’attività di riparazione, piuttosto che controlli di analisi di per sé. È ‘essenziale’ di informazioni per segnalare il livello di riparazione del DNA, incisioni in nucleoids da: (i) non esposti substrato cellule incubate con buffer di reazione, per determinare il livello basale di danno al DNA nel substrato di DNA (cioè, il ‘controllo di sfondo’); (ii) esposto le cellule incubate con buffer di reazione, per rivelare il livello di qualsiasi aspecifici DNA strand breaks o siti abasic derivante dal trattamento con l’agente lesivo (cioè, il ‘trattamento di controllo’); iii) cellule del substrato non esposte incubate con estratto proteico dal campione, per verificare la presenza di attività di incisione o scissione non specifica (ad esempio, il “controllo della specificità”); e iv) cellule del substrato esposte incubate con enzima specifico della lesione, simile ai controlli del saggio per il saggio comet modificato dall’enzima (ad esempio, il “controllo della reazione di incubazione”).

Fase 1D: Controlli negativi e positivi

In questo articolo, i controlli negativi e positivi si riferiscono ai gruppi sperimentali, come descritto nella linea guida dell’OCSE (TG 489) per il test comet in vivo nei tessuti animali18. Pertanto, i controlli negativi e positivi riguardano l’intero esperimento. Un controllo positivo si riferisce a un composto genotossico ad azione diretta o indiretta che produce rotture di filamenti di DNA o siti sensibili agli enzimi rilevati con il saggio comet. Per il saggio comet modificato dall’enzima, non è disponibile un elenco di controlli positivi che corrisponda ai composti elencati dall’OCSE come controlli positivi per il saggio comet alcalino (per indurre rotture del filamento di DNA) in specifici tessuti animali. Inoltre, non esiste un controllo positivo per gli studi di biomonitoraggio umano, poiché le persone sane non possono essere deliberatamente esposte a un agente genotossico. I controlli positivi sono già considerati obbligatori negli esperimenti di coltura cellulare in tossicologia genetica e saranno di fatto informazioni “essenziali” negli articoli che utilizzano il saggio comet. Negli studi sugli animali, tuttavia, per scopi pratici, i dati comet sui controlli di dosaggio (es., i campioni menzionati nella sezione precedente intitolata “Fase 1C, Controlli di dosaggio”) sono sufficienti, mentre i risultati dei controlli positivi e negativi sono considerati solo informazioni “desiderabili”.

Fase 2: Incorporamento delle cellule in agarosio

Il saggio comet è stato originariamente sviluppato utilizzando tre strati di agarosio su vetrini, con lo strato intermedio contenente le cellule. Tuttavia, lo strato superiore di agarosio non è necessario e alcune procedure non utilizzano uno strato inferiore (ad esempio, test di film di Gelbond). È’ auspicabile ‘ riportare il tipo di diapositive e le dimensioni (es., superficie) dei gel, poiché la proporzione delle cellule vicino al bordo del gel aumenta quando la dimensione del gel diminuisce e il DNA nei nucleoidi sul bordo del gel può migrare in modo diverso da quello nei nucleoidi verso il centro del gel22. La concentrazione finale di agarosio (con le cellule incorporate in esso) è “essenziale” da segnalare, poiché la migrazione del DNA dipende dalla densità del gel.

Fase 3: Lisi delle cellule

Ci sono diverse procedure per lisare le cellule nel saggio comet. Le informazioni sulla composizione della soluzione di lisi sono “essenziali”. Per alcuni tipi di cellule può essere necessaria una fase supplementare di incubazione enzimatica (ad esempio con la proteinasi K) e i dettagli dell’incubazione devono essere riportati anche come informazioni “essenziali”. Alcuni rapporti suggeriscono che la durata della lisi può influenzare la stabilità di alcuni tipi di lesioni del DNA 28,29,30, quindi la durata della lisi e la temperatura della soluzione di lisi sono informazioni “desiderabili” da riportare.

Fase 4A: Trattamento enzimatico di riparazione nel saggio comet modificato dall’enzima

Poiché la soluzione di lisi può inibire l’attività dell’enzima di riparazione, è “auspicabile” stabilire se è stata eseguita una fase di lavaggio tra la fase di lisi e il trattamento enzimatico (vale a dire, composizione del tampone di lavaggio, numero di lavaggi e durata). È “essenziale” trasmettere informazioni sulla fonte degli enzimi di riparazione, poiché è stato dimostrato che enzimi di diversi produttori differiscono sia per la loro attività che per la loro specificità rispetto alle lesioni nucleobasiche16. Nella maggior parte degli studi comet, gli esperimenti sulla curva di titolazione vengono eseguiti per identificare le condizioni ottimali per il trattamento enzimatico31; tuttavia, i risultati delle curve di titolazione enzimatica sono raramente riportati e sono classificati qui come informazioni “desiderabili” (si potrebbe invece fare riferimento a uno studio precedente), sebbene consideriamo “essenziale” riportare la durata e la temperatura del trattamento. La concentrazione dell’enzima applicato al gel è un’informazione “essenziale”; è preferibile riportare la concentrazione in unità enzimatiche (U/ml), sebbene anche la concentrazione proteica (mg/ml) sia utile. Il tipo di unità di incubazione (ad esempio incubatore, fossato scorrevole o sistema a 12 gel) e la modalità di incubazione sono informazioni “desiderabili” da segnalare. Va precisato se l’incubazione è stata eseguita (i) in un bagno enzimatico o con una goccia e un vetrino sul vetrino, (ii) in una versione standard a 2 gel, 12 gel o sistema a pozzetti multipli o (iii) in una scatola umidificata in un’incubatrice, su una piastra riscaldante o in un fossato di vetrino riscaldato.

Punto 4B: Preparazione e incubazione degli estratti per il test di riparazione del DNA in vitro

È “auspicabile” indicare il numero di cellule o la massa di tessuto utilizzati per preparare gli estratti proteici, mentre è “essenziale” indicare la concentrazione proteica finale degli estratti cellulari o tissutali aggiunti al DNA del substrato. La composizione del buffer di estrazione (informazioni “desiderabili”) è meno cruciale della composizione del buffer di incubazione (informazioni “essenziali”), poiché quest’ultima può influenzare il livello di fondo della migrazione del DNA. In linea con le informazioni relative al saggio comet modificato dall’enzima, è “auspicabile” riportare i risultati degli esperimenti di titolazione o fare riferimento a precedenti studi dello stesso laboratorio, dove sono stati eseguiti. Il volume di estratto aggiunto alle cellule del substrato incorporate nel gel è un’informazione “desiderabile”. È “essenziale” riportare la durata e la temperatura del periodo di incubazione perché queste influenzano il numero di incisioni di riparazione. Per quanto riguarda il saggio comet modificato dall’enzima, la modalità di incubazione è un’informazione “auspicabile” da riportare per il saggio di riparazione in vitro. Le informazioni sull’identità dell’enzima utilizzato come controllo della reazione di incubazione (indicando la quantità di lesioni del DNA nelle cellule del substrato) e la composizione del tampone utilizzato per il livello di fondo delle incisioni di riparazione del DNA nelle cellule del substrato non esposte sono “essenziali”, perché sono fondamentali per dimostrare l’affidabilità dell’attività di incisione di riparazione del DNA.

Fase 5: Trattamento alcalino

La soluzione ad alto pH alcalino interrompe il legame di idrogeno che tiene insieme i filamenti di DNA e converte anche alcune lesioni nucleobase in rotture di filamenti di DNA. Pertanto, la durata del trattamento alcalino può influenzare il livello di migrazione del DNA nella successiva elettroforesi 32,33,34. Informazioni specifiche riguardanti la composizione della soluzione alcalina, il pH, la temperatura e la durata del trattamento sono quindi informazioni “essenziali” da riportare.

Fase 6: Elettroforesi

I driver più importanti della migrazione del DNA sono la durata dell’elettroforesi e il potenziale elettrico (caduta di tensione attraverso la piattaforma del serbatoio di elettroforesi)35. È “essenziale” riportare la composizione del tampone di elettroforesi, la forza dell’elettroforesi (gradiente di tensione (V/cm) sulla piattaforma del serbatoio di elettroforesi) e la durata dell’elettroforesi. L’alta temperatura durante l’elettroforesi può influenzare la migrazione del DNA 36; pertanto, le informazioni sulla temperatura della soluzione di elettroforesi sono “essenziali” e ciò può essere accompagnato da descrizioni delle misure adottate per mantenere la temperatura costante (ad esempio, raffreddando la piattaforma o facendo circolare il tampone).

Punto 7: Neutralizzazione

Questa fase comporta la rimozione della soluzione alcalina in eccesso dai vetrini per garantire una colorazione efficiente. È’ auspicabile ‘ descrivere la composizione della soluzione di neutralizzazione.

Fase 8: Colorazione e visualizzazione

I coloranti che legano il DNA hanno affinità di legame diverse con il DNA e possono quindi influenzare il calcolo dei descrittori primari del test comet nel software di analisi delle immagini36,37,38. Il tipo di colorante è un’informazione “essenziale”, mentre la concentrazione è un’informazione “desiderabile”, così come il tempo tra la colorazione e la visualizzazione. L’intensità della luce proveniente da diversi tipi di lampade da microscopio differisce. Inoltre, varia a causa dell’età della lampada e del tempo in cui è stata accesa durante il punteggio delle comete. Tuttavia, non esiste una procedura standard per misurare l’intensità della luce e correggere il livello di migrazione del DNA di conseguenza. Inoltre, la stessa cometa può sembrare avere diversi livelli di migrazione del DNA a diversi ingrandimenti del microscopio. Pertanto, è ‘auspicabile’ riportare l’ingrandimento del microscopio utilizzato per il punteggio. È’ auspicabile ‘ mostrare immagini rappresentative delle comete (ad es., controllo con poca o nessuna migrazione, migrazione moderata ed estesa del DNA) accanto ai livelli riferiti di migrazione del DNA.

Fase 9A: analisi del punteggio e dei dati

Questa fase richiede la segnalazione di informazioni “essenziali” per il descrittore primario del saggio comet (ad es.. % di DNA in coda, lunghezza della coda, momento della coda o punteggio visivo), il numero di comete analizzate per campione e come viene espresso il livello complessivo di migrazione del DNA (ad esempio, mediana o media dei punteggi delle comete). Non è importante riportare il risultato individuale di ogni cometa in ogni gel; sono combinati per calcolare il livello di danno complessivo. Poiché non si può escludere che diversi pacchetti software di analisi delle immagini possano avere modi diversi per calcolare il predittore primario del saggio comet, è “essenziale” riportare il software utilizzato (nome del software, produttore, versione). Tutti i principali descrittori di condividere la limitazione che è necessario avere esperienza con il test della cometa per capire che cosa significano, mentre se una curva di calibrazione viene creato (utilizzo di radiazioni ionizzanti, che induce rompe in un noto frequenza), i risultati possono essere convertiti relativa lesione frequenza rispetto al inalterato nucleotidi o azotata coppie; tali dati sono inequivocabili e trasmettere informazioni che tutti i ricercatori possono understand39. La procedura per ottenere una curva di calibrazione, utilizzando radiazioni ionizzanti, e convertire i livelli di migrazione del DNA alla frequenza della lesione rispetto a nucleotidi inalterati o coppie di nucleobasi è stata riportata in precedenza40. Pertanto, riportare i risultati come livelli di lesioni per 109 nucleotidi inalterati o 106 coppie di nucleobasi è “desiderabile”.

Passo 9B: Calcolo dei siti sensibili agli enzimi o del numero netto di incisioni nel DNA del substrato per il test di riparazione del DNA in vitro

L’incubazione con enzimi di riparazione del DNA aumenta il livello di migrazione del DNA, poiché sia il livello basale delle rotture del filamento di DNA che le lesioni specifiche degli enzimi contribuiscono al numero totale di rotture del filamento di DNA. Poiché la migrazione del DNA attribuita al livello basale di danno al DNA e alle lesioni specifiche dell’enzima può provenire da diversi meccanismi di genotossicità, non è sufficiente riportare solo il livello totale di danno al DNA dopo il trattamento enzimatico. Invece, è “essenziale” segnalare la genotossicità come siti sensibili agli enzimi, in cui il livello basale di migrazione del DNA è stato sottratto dalla migrazione del DNA nei vetrini trattati con enzimi.

Poiché il test di riparazione del DNA in vitro utilizza le stesse cellule di substrato con tutti i campioni di estratto cellulare o tissutale, non è necessario disporre di controlli simultanei di background e di trattamento per ciascun campione nello stesso esperimento (ad esempio, esecuzione del test). Potrebbe esserci più di un substrato (ad es., analizzando sia l’attività di riparazione di base – che nucleotide-escissione), e perciò i controlli separati per ogni tipo di analisi di riparazione di DNA sono necessari. È “essenziale” riportare le incisioni nette dell’estratto di riparazione nel DNA del substrato.

Fase 9C: Analisi statistica dei risultati

Le analisi statistiche sono “essenziali”. Il tipo di analisi statistica dipende dalla progettazione dello studio e segue le ipotesi generali nei test statistici in tossicologia genetica e biomonitoraggio41,42.