Una visione critica sulle mutazioni conservative

Abstract

Analizzando la composizione superficiale di un insieme di strutture proteiche 3D, integrate con informazioni sulla composizione superficiale prevista per proteine omologhe, abbiamo trovato prove significative per una composizione a strati di strutture proteiche. Nelle parti più interne ed esterne delle proteine c’è una carica negativa netta, mentre la metà ha una carica positiva netta. Inoltre, i nostri risultati indicano che il concetto di mutazione conservativa ha bisogno di una revisione sostanziale, ad esempio sono state trovate preferenze spaziali molto diverse per l’acido glutammico e l’acido aspartico. Lo screening dell’alanina spesso utilizzato nei progetti di ingegneria proteica comporta la sostituzione dei residui con l’alanina, sulla base del presupposto che l’alanina sia un residuo “neutro”. Tuttavia, l’alanina ha un’alta correlazione negativa con tutti tranne i residui non polari. Proponiamo quindi l’uso, ad esempio, della serina come sostituto dei residui che sono negativamente correlati con l’alanina.

Introduzione

Dopo la piegatura di una catena peptidica in una struttura proteica 3D, alcuni residui vengono trasferiti da un ambiente polare a un ambiente più non polare all’interno della proteina piegata. Questo trasferimento è guidato dalle proprietà termodinamiche degli amminoacidi e del solvente. In tutta l’evoluzione molecolare la natura ha selezionato per la funzione adatta e la stabilità della proteina risultante. Per le proteine di piccole e medie dimensioni-nella struttura piegata-solo pochi residui sono totalmente sepolti ( Chothia, 1976; Miller et al., 1987; Petersen et al., 1998), mentre la maggior parte dei residui sono sepolti solo parzialmente. La variazione dell’accessibilità del solvente dipende dalle proprietà del residuo in questione e si riflette nella composizione aminoacidica in tutta la struttura proteica. Queste differenze nel profilo di accessibilità del solvente hanno trovato ampie applicazioni in vari metodi di previsione della struttura (Holbrook et al., 1990 ; Rost e Sander, 1994; Thompson e Goldstein, 1996 ). Inoltre, l’uso di matrici di sostituzione specifiche per l’ambiente ( Donnelly et al., 1994; Wako e Blundell, 1994) si sono dimostrati preziosi. Il vicinato sequenziale degli amminoacidi è stato studiato in precedenza (Vonderviszt et al., 1986 ) e il suo uso è stato trovato, ad esempio, nella previsione del ciclo ( Wojcik et al., 1999) e previsione della struttura secondaria ( Chou e Fasman, 1978 ; Chandonia e Karplus, 1999 ; Jones, 1999). Non è stata scoperta alcuna correlazione significativa tra residui preferenza sequenziale vicino.

Anche il quartiere spaziale attorno ai singoli residui è stato precedentemente studiato ( Burley e Petsko, 1985; Bryant e Amzel, 1987 ; Miyazawa e Jernigan, 1993 ; Petersen et al., 1999 ). Inoltre, i contatti spaziali sono stati studiati per ricavare potenziali di contatto per le diverse interazioni aminoacidiche (Brocchieri e Karlin, 1995 ; Miyazawa e Jernigan, 1996 , 1999 ). La strategia comune consiste nello studio del numero di contatti entro un determinato limite di distanza. Tuttavia, la letteratura sembra priva di indagini su contatti dipendenti dalla distanza e anche di relazioni che utilizzano le informazioni incorporate sull’accessibilità solvente dei residui coinvolti.

È stata riportata una previsione a due stati della correlazione di accessibilità del solvente tra idrofobicità, propensione al contatto interrato e posizione nella finestra di previsione ( Mucchielli-Giorgi et al., 1999 ). Tuttavia, non descrive alcuna correlazione tra le singole distribuzioni di residui.

È importante essere in grado di discriminare tra strutture modello correttamente piegate e non ripiegate. È stato sottolineato che i potenziali metodi basati sull’energia non discriminano bene tra le strutture piegate e quelle non piegate. Tuttavia, caratteristiche strutturali come la superficie polare sepolta (Overington et al., 1992) e numero di contatti polari ( Bryant e Amzel, 1987 ; Golovanov et al., 1999) si sono dimostrati preziosi.

Nell’ingegneria delle proteine viene spesso utilizzato il concetto di mutazioni conservative. L’idea generale è che una sostituzione di un amminoacido con un altro amminoacido con proprietà fisico-chimiche simili non influenzerà la stabilità e la funzione della proteina. Il presente documento mostra che le preferenze spaziali per residui simili possono essere drammaticamente diverse nelle strutture proteiche in circostanze simili (in questo contesto accessibilità ai solventi).

I risultati dell’analisi neighbour saranno preziosi nella validazione del modello, come strumento per la previsione della struttura e soprattutto come guida nella ricerca di mutazioni che migliorano la stabilità.

Metodi

Le sequenze utilizzate sono un sottoinsieme del 25% sequence identity set di strutture non omologhe ( Hobohm et al., 1992 ; Hobohm e Sander, 1994 ) derivati dalla banca dati della struttura proteica PDB (Bernstein et al., 1977 ). Sono state utilizzate solo sequenze proteiche a catena singola. Il set di dati risultante consisteva in 336 sequenze a catena singola con un’identità di sequenza a coppie massima del 25%. Il sottoinsieme è stato ampliato attraverso l’uso dei corrispondenti file HSSP ( Dodge et al., 1998 ). Il set di dati totale conteneva 8379 sequenze allineate e 1 415 986 residui. Ciò corrisponde al 6,7% di tutti i residui nella versione 34 di SWISS-PROT ( Bairoch e Apweiler, 1997 ). La lunghezza delle sequenze era compresa tra 64 e 1017 residui. La risoluzione delle strutture a raggi X utilizzate variava tra 1,0 e 3,0 Å, con una media di 2,0 Å. Inoltre, il sottoinsieme conteneva 31 strutture risolte da NMR. Tuttavia, tutte le coordinate idrogeno-atomo sono state scartate. Per verificare un possibile bias introdotto dall’uso delle sequenze omologhe è stata effettuata l’analisi completa con e senza le sequenze allineate. Non sono state osservate differenze significative, anche se la dimensione ridotta del più piccolo dei due set di dati, come previsto, ha dato luogo a più rumore.

I vicini spaziali di ciascun residuo sono stati determinati in base all’accessibilità del solvente e alla distanza spaziale. L’accessibilità del solvente è stata presa dai rispettivi file HSSP (Dodge et al., 1998 ). Per ciascun residuo superficiale, i residui superficiali vicini sono stati raggruppati in base alla loro distanza dal residuo in questione. La distanza tra due residui è stata calcolata come la distanza più breve tra l’insieme di tutte le possibili coppie di atomi nei due residui. Supponiamo che l’allineamento nel file HSSP implichi che i vicini nella sequenza principale siano anche vicini nelle sequenze allineate e che l’accessibilità del solvente sia conservata ( Andrade et al., 1998; Goldman et al., 1998 ). Il numero previsto per il prossimo interazioni tra residui di tipo i e j sono calcolati

dove xi e xj sono la frazione di aminoacidi i e j nel set di dati per il campo di distanza d e un solvente di accessibilità maggiore rispetto al cut-off ACC e N0 è il numero totale di osservato il prossimo contatti. Il punteggio, Sij / d,ACC, è calcolato da

Questo dà un punteggio negativo per le coppie di vicini sfavorite e un punteggio positivo per le interazioni favorite. Il valore del punteggio Sij / d,ACC può essere trasformato in un parametro termodinamico apparente moltiplicando con RT .

È stata calcolata la carica netta in ogni strato della proteina. L’acido aspartico e l’acido glutammico sono considerati caricati negativamente e l’arginina e la lisina sono considerati caricati positivamente. L’istidina è considerata non carica o carica positivamente. La carica netta relativa, Δ qrel , definiamo come

dove NPositivo è il numero di residui positivi, NNegativo il numero di residui negativi e ntotale il numero totale di residui in quel particolare strato.

The PDB identification codes for the structures used are 1ptx, 2bbi, 1hcp, 1iml, 1cdq, 1vcc, 1nkl, 1tiv, 2abd, 2hts, 1tpg, 1fbr, 1pco, 1who, 1beo, 2ncm, 1fim, 1tlk, 1xer, 1onc, 1rga, 1erw, 1fd2, 1put, 1fkj, 1jpc, 1thx, 1jer, 1ccr, 1wad, 2tgi, 1pls, 1neu, 4rhn, 1rmd, 1hce, 1hfh, 1tam, 2pf1, 1bip, 1whi, 1yua, 1bp2, 1zia, 4fgf, 7rsa, 1bw4, 2vil, 1eal, 1rie, 1doi, 3chy, 1cpq, 1msc, 1mut, 1rcb, 1lzr, 1htp, 1lid, 1lis, 1lit, 1kuh, 1nfn, 1irl, 1poc, 2tbd, 1cof, 1pms, 1rsy, 1snc, 1eca, 1jvr, 2end, 1anu, 5nul, 1fil, 1jon, 1lcl, 1itg, 1tfe, 1maz, 1pkp, 1lba, 1vsd, 2fal, 1ash, 1def, 2hbg, 1div, 1gds, 1grj, 1i1b, 1ilk, 1rcy, 1sra, 1ulp, 1mbd, 1aep, 1jcv, 2gdm, 1phr, 1rbu, 1esl, 1hlb, 1mup, 1vhh, 1gpr, 1btv, 1cyw, 1klo, 1l68, 3dfr, 2cpl, 1sfe, 1huw, 5p21, 1ha1, 1wba, 1lki, 2fha, 1prr, 2fcr, 1amm, 1cid, 1hbq, 1cdy, 2stv, 153l, 1rec, 1xnb, 2sas, 1gky, 1knb, 1ryt, 1zxq, 1har, 1cex, 1chd, 2tct, 2ull, 1gen, 1iae, 1nox, 1rnl, 2gsq, 1cfb, 1dyr, 1nsj, 2hft, 1fua, 2eng, 1thv, 1hxn, 2abk, 9pap, 1lbu, 3cla, 1vid, 2ayh, 2dtr, 1gpc, 1dts, 1jud, 1emk, 1ois, 1akz, 1sgt, 1ad2, 1nfp, 1din, 1lrv, 1dhr, 1bec, 1lbd, 1dpb, 1jul, 1mrj, 1fib, 1hcz, 1mml, 1vin, 1dja, 2cba, 3dni, 1lxa, 1arb, 1rgs, 1tys, 3tgl, 1ako, 1eny, 1ndh, 2dri, 1xjo, 1drw, 1kxu, 2prk, 1cnv, 1tfr, 1ytw, 1iol, 2ebn, 1tml, 1han, 1xsm, 1pbn, 1amp, 1ryc, 1bia, 1vpt, 1csn, 2ora, 1ctt, 1bco, 1fnc, 1gym, 1pda, 1cpo, 1esc, 2reb, 1mla, 1sig, 8abp, 1ghr, 1iow, 2ctc, 1gca, 1sbp, 1ede, 1pgs, 2cmd, 1anv, 1gsa, 1tag, 1dsn, 2acq, 1cvl, 1tca, 2abh, 2pia, 1pot, 1vdc, 1axn, 1msk, 1hmy, 2bgu, 1ldm, 1dxy, 1ceo, 1nif, 1arv, 1xel, 1uxy, 1rpa, 2lbp, 3pte, 1uby, 1fkx, 1pax, 3bcl, 1air, 1mpp, 2mnr, 1eur, 1cem, 1fnf, 1pea, 1omp, 2chr, 1pud, 1kaz, 1mxa, 1edg, 2sil, 1ivd, 1pbe, 1svb, 1ars, 1oyc, 1inp, 1oxa, 1eft, 1phg, 1cpt, 1iso, 1qpg, 2amg, 1uae, 1gnd, 2dkb, 1gpl, 1csh, 4enl, 1pmi, 1lgr, 1nhp, 1gcb, 1bp1, 1geo, 2bnh, 3grs, 1gln, 1gai, 2pgd, 2cae, 2aaa, 1byb, 1smd, 2myr, 3cox, 1dpe, 1pkm, 1ayl, 1crl, 1ctn, 1clc, 1tyv, 2cas, 1ecl, 1oxy, 1vnc, 1gal, 1dlc, 1sly, 1dar, 1gof, 1bgw, 1aa6, 1vom, 8acn, 1kit, 1taq, 1gpb, 1qba, 1alo e 1kcw.

Risultati e discussione

La distribuzione dei residui caricati in diversi strati della struttura della proteina 3D e la carica netta totale sono mostrati in Figura 1 . Nelle parti più interne ed esterne delle proteine c’è una carica negativa netta, mentre la metà ha una carica positiva netta. Questa apparente struttura a tre strati con carica alternata che espone lo strato più esterno caricato negativamente al solvente è interessante. Tale organizzazione garantirà un certo livello di neutralizzazione della carica radiale e potrebbe eventualmente contribuire a un imballaggio stretto della proteina. Allo stesso modo questa organizzazione della carica dello strato superficiale potrebbe fornire un’importante guida elettrostatica durante l’evento di piegatura. Al contrario, la variazione del pH in condizioni acide o alcaline in cui sottoinsiemi dei residui titolabili non vengono caricati destabilizzerà l’imballaggio dei residui sulla superficie della proteina. Gli amminoacidi acidi sepolti possono essere trovati in diverse strutture proteiche e questi residui svolgono importanti ruoli funzionali, ad esempio, nella tripsina ( McGrath et al., 1992), ribonucleasi T1 (Giletto e Pace, 1999 ) e tioredossina (Dyson et al., 1997; Bhavnani et al., 2000 ). La struttura a tre strati riportata è osservata sia con che senza la sequenza allineata e quindi non è causata da un pregiudizio introdotto dalla conservazione dei gruppi sepolti e carichi all’interno di una famiglia di proteine.

I vicini spaziali attorno a ciascun tipo di residuo sono stati calcolati senza alcuna discriminazione per l’accessibilità del solvente. Con le notevoli eccezioni del triptofano e della cisteina, gli amminoacidi non sono stati frequentemente osservati come vicini spaziali a tipi di residui identici. Questa tendenza non dipendeva dalla scelta del limite di distanza (risultati non mostrati). Le differenze nella distribuzione erano notevolmente piccole tra i diversi amminoacidi per un cut-off di distanza di 8 Å, suggerendo che 8 Å è una distanza abbastanza grande perché la distribuzione diventi indipendente dalla natura del residuo centrale. Questa osservazione ha portato all’uso di 8 Å come la più grande distanza tra i vicini studiati in dettaglio.

La figura 2 mostra i valori di punteggio per tutte le coppie di vicini di aminoacidi che coinvolgono triptofano, glicina, alanina, prolina, serina, istidina, lisina e acido aspartico per le coppie di vicini con almeno il 20% di accessibilità ai solventi. I risultati per gli altri aminoacidi sono disponibili sulla nostra homepage (http://www.bio.auc.dk/). I valori di punteggio sono stati calcolati in modo simile per altri limiti di accessibilità ai solventi. Il triptofano residuo aromatico è uno dei soli due residui che mostrano una chiara preferenza per i contatti con lo stesso tipo di residuo (l’altro è cisteina). Anche le interazioni con gli altri residui aromatici sono preferite. È interessante notare che le interazioni tra triptofano e i due residui acidi (acido aspartico e acido glutammico) sembrano diverse. Mentre il triptofano e l’acido glutammico sono osservati meno frequentemente del previsto, si osserva il contrario per il triptofano e l’acido aspartico. La glicina mostra il tipico punteggio negativo per le interazioni con lo stesso tipo di residuo. Inoltre, la glicina non sembra avere vicini nel vicino quartiere spaziale (≤3,5 Å). Questa sottorappresentazione dei vicini vicini è ancora più chiara per proline. Interpretiamo questa sottorappresentazione come un segno della preferenza per il ciclo che hanno i residui di prolina. La mancanza di interazioni con tutti gli altri amminoacidi nelle sue vicinanze indica che la maggior parte dei contatti è con molecole di solvente. Tuttavia, la prolina ha un’abbondanza di contatti a una distanza maggiore (4-5 Å). L’istidina è interessante in quanto mostra segni delle sue proprietà aromatiche, attraverso la preferenza per i contatti con residui aromatici (~3,5 Å), e la sua natura polarizzabile, attraverso i contatti preferiti con i residui caricati negativamente (~3 Å). L’aminoacido lisina di base ha come previsto un chiaro punteggio negativo per i contatti con altre lisine. Le interazioni elettrostatiche favorevoli con gli amminoacidi acidi sono evidenti.

Alcune delle interazioni di coppia più interessanti sono mostrate in Figura 3 . Figura 3A raffigura la coppia ponte sale acido lisina-aspartico. La forte sovrarappresentazione vista alla separazione di 3 Å è coerente con il classico concetto di ponte di sale. La sovrarappresentazione delle coppie di acido lisina–aspartico negli strati più esposti al solvente osservati a 5,5-6 Å è inattesa. Proponiamo che le reti di carica sulla superficie proteica potrebbero causare questa osservazione. Nella Figura 3B viene mostrato il risultato per la coppia acido glutammico–acido aspartico. La caratteristica più ovvia è la sottorappresentazione prevista di questa coppia. Tuttavia, vicino alla superficie della proteina la stessa restrizione non sembra essere presente. Ancora una volta proponiamo che le reti di carica localizzate in superficie contribuiscano a questa osservazione. Nelle figure 3C e D sono mostrate le coppie di aminoacidi triptofano–acido glutammico e triptofano–acido aspartico. La credenza comune che un acido glutammico alla mutazione dell’acido aspartico sia conservativa è contraria alle osservazioni mostrate. La coppia triptofano-acido glutammico è altamente sottorappresentata negli strati altamente esposti al solvente delle proteine. Sorprendentemente, lo stesso non si può dire per la coppia di acido triptofano–aspartico, dove si osserva una sovrarappresentazione per l’intervallo di distanza da 3,5 a 6 Å. Osservazione simile, ma meno pronunciata, è stata fatta per le coppie di acido tirosina–glutammico e acido tirosina–aspartico. Non sono state osservate differenze significative tra le coppie fenilalanina–acido glutammico e fenilalanina–acido aspartico. L’unica differenza tra l’acido glutammico e l’acido aspartico è la lunghezza della catena laterale. Comune sia al triptofano che alla tirosina è la loro polarisabilità, in contrasto con la fenilalanina. Crediamo che i triptofani localizzati in superficie coinvolti nella definizione della funzionalità proteica siano polarizzati dal loro ambiente elettrostatico locale. Sebbene non possiamo fornire una spiegazione quantitativa, è plausibile che le differenze tra la diversa lunghezza della catena dell’acido glutammico e dell’acido aspartico possano privilegiare la vicinanza al triptofano. È stato dimostrato che l’acido aspartico ha la tendenza ad avere interazioni favorevoli tra il gruppo carbonilico della catena laterale e il gruppo carbonilico della spina dorsale (Deane et al., 1999), risultando in una struttura ad anello. Conformazioni simili non sono state osservate per l’acido glutammico. Nelle figure 3E e F sono mostrate le coppie istidina-acido aspartico e serina-istidina. Poiché questi tre residui costituiscono i residui del sito attivo di un’ampia gamma di idrolasi, rivestono particolare interesse. C’è una sovrarappresentazione di coppie di acido istidina-aspartico nelle aree altamente accessibili ai solventi. La distanza è maggiore della distanza tipica osservata nei crepacci del sito attivo. Tuttavia, la piccola, ma significativa, sovrarappresentazione nell’intervallo 3 Å è conforme alle classiche distanze dell’acido istidina-aspartico nelle idrolasi. La figura 3E mostra la chiara preferenza per i contatti tra istidine sepolte e acidi aspartici. Crediamo che questa caratteristica sia una parte importante dell’evoluzione molecolare dei siti catalitici de novo. La memorizzazione di possibili “triadi” catalitiche in ambienti non funzionali riduce il numero di sostituzioni di aminoacidi necessarie per attivare il sito.

La caratteristica più distinta nella Figura 3F è la chiara sottorappresentazione delle coppie serina-istidina in ambienti altamente esposti ai solventi. Una debole sovrarappresentazione della coppia serina–istidina è osservata a 3 Å nelle aree meno accessibili ai solventi. Quindi la presenza della triade catalitica apparentemente è determinata principalmente dalla preferenza della coppia di acido istidina–aspartico sebbene la coppia serina–istidina riveli tendenze simili, ma molto più deboli.

È stata determinata la composizione aminoacidica di ogni strato di accessibilità del solvente. Come previsto, le parti sepolte delle proteine sono composte da una maggiore quantità di residui non polari rispetto agli strati più esposti al solvente. La correlazione tra la composizione aminoacidica è stata calcolata dai dati della composizione dei singoli strati strutturali. Si prevede che gli amminoacidi che hanno preferenze simili per il contatto con solventi e l’ambiente locale mostrino un’elevata correlazione positiva a causa di tendenze simili nella loro distribuzione. Quindi, gli amminoacidi che mostrano una correlazione negativa avranno preferenze diverse per l’ambiente locale e quindi non sono ritenuti compatibili, cioè una singola mutazione del sito di questo tipo in questa posizione non è raccomandata. Poiché i residui non polari sono abbondanti nel nucleo e mostrano una diminuzione graduale all’aumentare dell’accessibilità del solvente in generale, la correlazione tra i residui non polari è positiva (Figura 4 ). Al contrario, i residui polari sono più abbondanti nelle parti altamente esposte e quindi sono negativamente correlati con i residui non polari. Istidina e treonina si comportano in modo marcatamente diverso. Mostrano una correlazione positiva tra loro, ma poca correlazione con una qualsiasi delle altre colonne, ad eccezione di arginina e glicina. Ciò è causato dal basso verificarsi di istidina e treonina in entrambe le aree sepolte e altamente esposte e dalla loro presenza relativamente elevata negli strati esposti al mezzo. L’istidina ha una correlazione positiva con due residui aromatici, triptofano e tirosina, e con la treonina debolmente polare e l’arginina polare. Ancora una volta interpretiamo questo come un segno sia delle proprietà aromatiche che delle proprietà di carica dell’istidina. I residui debolmente polari non hanno la stessa chiara somiglianza nella distribuzione dei residui polari e non polari. Prolina e serina sembrano essere più strettamente correlati ai residui polari. L’alanina residuo debolmente polare ha una correlazione positiva solo con i residui non polari. Proponiamo che le mutazioni tra residui con alta correlazione positiva abbiano un’alta probabilità di mantenere la stabilità termodinamica della struttura 3D. Ciò è particolarmente vero per i residui caricati. Al contrario, i residui con un alto grado di correlazione negativa sono tipicamente residui con diverse proprietà fisico-chimiche, che non possono essere scambiati senza modificare la chimica fisica della proteina. I residui non correlati coinvolgono residui con un ruolo speciale nella struttura, ad esempio alcuni residui spesso coinvolti nella catalisi. Crediamo che l’osservazione che la prolina nel nostro studio si comporta in modo simile ai residui polari sia correlata al ruolo strutturale dei residui di prolina e alla sua preferenza per loop e spire. Lo screening dell’alanina spesso utilizzato nei progetti di ingegneria proteica comporta la sostituzione dei residui con l’alanina, sulla base del presupposto che l’alanina sia un residuo “neutro”. Tuttavia, i nostri dati mostrano che l’alanina ha un’alta correlazione negativa con tutti tranne i residui non polari. Proponiamo quindi l’uso, ad esempio, della serina come sostituto dei residui che sono negativamente correlati con l’alanina.

Secondo gli autori, il presente documento fornisce nuove importanti informazioni sull’organizzazione strutturale delle proteine. La superficie proteica dovrebbe essere vista come una caratteristica strutturale multistrato della proteina, in cui ogni strato ha la sua composizione specifica e le sue caratteristiche risultanti. Questa semplice osservazione chiave crediamo sarà di importanza significativa per molte strategie di ingegneria delle proteine che mirano alla modifica dei residui esposti al solvente.

P. H. J. ringrazia il Consiglio di Ricerca della Norvegia per il sostegno finanziario (NFR-116316/410). Pressione sanguigna. esprime la sua gratitudine per il sostegno finanziario da Obelsk Familiefond così come Mål-2.