クロムリリースアッセイ：細胞傷害性T細胞をテストする古い学校の方法
あなたのT細胞が細胞傷害性であるかどうかを確認するために使用できる それはよい結果を与え、すぐに利用できる流れのcytometryをできることができないか、または持っていない実験室のために大きい。
ここでは、51crを使用してT細胞死機能をテストするための簡単な方法を概説します。 しかし、アッセイを開始する前に、放射性物質を取り扱う際の適切な安全対策を必ずお読みください。
ターゲットとエフェクターを選択
クロム放出アッセイを行うには、最初にターゲット細胞（T）を51crでインキュベートします。 その後、標的細胞をエフェクター細胞（あなたのT細胞;E）でインキュベートします。 エフェクターセルがターゲットを殺すと、51crが放出され、ガンマカウンターで検出されます。
どのターゲットとエフェクタを使用するかは、アプリケーションに完全に依存します。 あなたの標的細胞は、あなたがT細胞機能をテストしているものです。 ターゲットを殺す（細胞毒性を測定する）か、T細胞が耐性であるかどうかを調べることができます（安全のために患者に入る前に製造された細胞をテス). あなたのエフェクター T細胞はまた、異なる供給源から誘導することができます。 例えば、製造されたＴ細胞株または動物から新たに単離されたＴ細胞を使用することができる。
放射性物質を手に入れよう
あなたの目標とエフェクターを集めたら、料理を手に入れる時間です。
- あなたのセルを数えます。 血球計または自動細胞カウンターを使用することができます。 必要なセルの数は、条件の数と、各条件の反復数に依存します。 一般的に、私は三重に私のアッセイを実行し、四つの比率を持っています(5:1, 10:1, 20:1 および40:1E:T）。 あなたの標的細胞（私の場合は500,000-井戸あたり約25,000）を15mlの円錐管に分け、各実験条件を別々に保ちます！ 彼らはクロムと接触する機会を持っているので、あなたは小さなボリュームであなたの細胞を中断していることを確認してください。
- 51Cr（約50μ Ci）を加え、1時間クロムでターゲットをインキュベートします。 管を通風管に細胞のための機会をクロム高めるために約20分毎にフリックして下さい。
- あなたがインキュベートしている間…。この長い孵化はあなたのエフェクターの細胞をセットアップする大きい時間である。 あなたの結果を歪める可能性が過剰なサイトカインを除去するためにPBSでt細胞を二回洗浄します。 次に、それらを適切なメディアに再懸濁させます。
- 洗浄を終えたら、版にあなたのエフェクターを置いて準備ができています! ボリュームがかなり小さいので、私は通常、96ウェルプレートを使用します。 殺害のしきい値を決定するために、ターゲットに異なる比率でエフェクタをプレート。 私は通常、三重でアッセイを実行しますが、それはあなたが利用可能な細胞の数に依存します。 使用可能なセルが十分にある場合は、40、20、10、および5対1の比率（エフェクタとターゲット）が適したテンプレートです。
これらのテストに加えて、二つの制御条件を設定します:
- 標的細胞だけを含む自発放出コントロール（エフェクターなしで殺すべきではないため、基本的には陰性コントロール）と
- 標的細胞を溶解する最大放出コントロール（細胞に取り込まれるクロムの最大量を示す陽性コントロール）。
- それらの標的細胞に戻って…あなたの標的細胞がインキュベート完了したら、余分なクロムを除去するために細胞培養培地でそれらを三回洗浄します。 これらの洗浄のそれぞれのための5分の400gで細胞を穏やかに回して下さい。 それをピペットにすることを試みるよりもむしろ安全な腐食区域に移すことができる廃棄物容器に上清をデカントして下さい。 これは、任意のヒントに対処する必要はありませんので、可能な汚染を減らすのに役立ちます。
- 洗浄の後で、100つごとの5000の細胞にあなたの細胞をresuspendか。その後、100を追加しますか？各井戸への細胞のl、自発および最高の井戸。 細胞を37°Cで最低4時間一緒に孵化させて下さい、丁度どの位あなたの適用によって決まります。
- 四時間後…。インキュベーターからプレートを取り出してください。 100を追加？細胞を分解し、すべてのクロムを解放する最高の井戸のあなたの細胞への1%triton-xの解決のl。
- 細胞を餌にするために10分の1250rpmで版を回して下さい。
- ウェルの底部にあるペレットに触れないように注意しながら、各ウェルから吸収板（例えば、ルマ板）のウェルに上清を移します。
- プレートを一晩乾燥させたままにする。 朝、版の読者にそれをぽんと鳴らし、あなたの結果を得なさい。
あなたが見る結果はあなたの特定の適用によって決まります
あなたのChromium解放の試金の結果の計算
読書を得たら、あなたの細胞の細胞毒性を定めるために簡単な計算を行う必要があります。
まず、条件ごとに三重を平均します。 次に、これらの平均値を取り、この式に差し込みます:
(関心のある状態のクロムリリース–自発ウェルでのクロムリリース)/(最大クロムリリース–自発ウェルでのクロムリリース)
値に100を掛けて溶解率を得ます。
