Frontiers/the comet assay:past,present,and future/Genetics

アルカリcomet assay(single cell gel electrophoresis)は、真核細胞におけるDNA損傷を測定するために最も広く使用されている方法です(Neri et al., 2015). それは細胞ごとの数百から数千の壊れ目からの頻度で繊維の壊れ目(SBs)およびアルカリ不安定な場所を検出する-低い内生損傷のレベルから細胞を殺溶解後、ある種の病変特異的修復エンドヌクレアーゼを用いて核様体を消化することにより、SBs以外の損傷の測定が可能になり、特にホルミドピリミジンDNAグリコシラーゼ(FPG)は酵素によって切断に変換される変化したプリンを検出するために広く使用されている。最近、（Cortés-Gutiérrez et al. 2014年）は、精子の同じ彗星で一本鎖（SSBs）と二本鎖DNA切断（DSBs）を区別することができる二次元二尾彗星アッセイ（TT-comet）を開発しました。

ostling and Johanson(1984)による最初の報告以来、cometアッセイは、in vitroおよびin vivoモデルの両方で、化学物質の遺伝毒性試験に広く使用されてきました。後者の利点は、様々な組織からの細胞を、多種多様な真核生物において研究することができることである。最後の15年の間に、彗星の試金はショウジョウバエのmelanogasterで広く化学薬品（Gaivãoおよび山脈、2014年）の遺伝毒性をテストするのに使用されていました。ショウジョウバエmelanogasterはDNAの損傷の応答を含む人間の健康と、関連しているいろいろな種類のプロセスのための貴重なモデルであるのでこのアプローチは非常に有用である。

コメットアッセイにおける植物だけでなく、幅広い陸生種および水生種の使用は、過去十年間で劇的に増加している(Costa et al. ら、２０１４；ｄｅＬａｐｕｅｎｔｅら、２０１５。ら、２０１５；Ｓａｎｔｏｓｅｔａｌ．,2015),特に環境リスク評価(ERA). 最近の検証研究では、FPGと組み合わせたin vitro cometアッセイは、河口環境などの特に困難な自然のシナリオにおいても、ERAにおける効果的な補完的な証拠, 2014).

過去10年間、ナノサイズの材料の生産と使用が大幅に増加し、その結果、これらのタイプの材料への人間の曝露が増加しました。人間の健康に関連したナノ材料（NMs）の危険性を特定し、理解することは簡単な問題ではありません。 NMsの化学組成は遺伝毒性の原因であるだけでなく、形状、比表面積、サイズ、サイズ分布、ゼータ電位によって、これらの物質がゲノムに及ぼす影響が決定され NMsの効果を研究するための標準的な遺伝毒性アッセイの適合性についてはまだ議論がありますが、これまでのところ、ナノ遺伝毒性学で最も使用されている方法は、その堅牢性、汎用性、および信頼性のおかげで、コメットアッセイでした（Azqueta and Dusinska、2015）。放射線および種々の化学物質の遺伝毒性の調査に加えて、植物彗星アッセイは、最近、Ｎｐの遺伝毒性の影響を研究するためにも使用されている（Ｓａｎｔｏｓｅｔａｌ．, 2015).

コメットアッセイのさらなる応用は、ヒトバイオモニタリングおよび臨床研究のための貴重な実験ツールとしてである。血液または組織を収集することは、すべてのヒト対象において必ずしも実現可能ではなく、非侵襲的に収集することができる他の細胞源が、ｃｏｍｅｔアら、2014）ならびに精子（Cortés-Gutiérrez et al. ら、２０１４；Ｂｒｕｎｂｏｒｇｅｔａｌ．, 2015).

dna損傷測定のためのcometアッセイの開発と並行して、遺伝毒性細胞応答に不可欠な要素であるDNA修復のアッセイが開発されています。 DNA修復測定の最も簡単なアプローチは、DNA損傷剤で細胞を処理し、それらをインキュベートして修復を進行させ、間隔で残っている損傷の量を測定するこ修復能力を評価するための代替の生化学的アプローチが、１９９４年に記載されている（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｔａｌ．Ｂｅｒ（ｂａｓｅｅｘｃｉｓｉｏｎｒｅａｐｅｒ）およびｎｅｒ（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｅｘｃｉｓｉｏｎｒｅａｐｅｒ）の両方を測定するためのアッセイの種々の改変版が出版されている（Ａｚｑｕｅｔａｅｔａｌ．，１９９４）。, 2014). この生化学的アプローチは、臨床調査に加えて、DNA修復能力に対する環境、栄養、生活様式、および職業の影響を研究するために適用されている（Azqueta et al., 2014).

DNA修復に対するこの代替的なin vitroアプローチは、定義された病変を含むDNA基質上の細胞抽出物の修復活性を評価する。彗星の試金が孵化の時のDNAの壊れ目（修理中間物）の蓄積に続くのに使用されています。最近、Slyskovaらは、BERおよびNERのin vitro DNA修復アッセイをヒト組織試料、具体的には結腸直腸癌生検（Slyskovaら、1999年）に初めて成功させた。, 2012, 2014).

ゲルに埋め込まれた細胞を溶解前に修復できる異なる種類のDNA修復アッセイが、DNA修復速度論をより詳細に研究するために最近採用されました; 具体的には、転写後修飾によるＢＥＲタンパク質の調節を研究する（ＮｉｃｋｓｏｎａｎｄＰａｒｓｏｎｓ，２０１４）。特定の遺伝子のレベルでDNA修復を研究する別の方法は、彗星尾部の一本鎖DNAにハイブリダイズする蛍光標識DNAプローブを使用するcomet-FISH技術です。 McAllister et al. (2014)は、この方法を用いて、積極的に転写された遺伝子を有する選択された領域と同様に、バルクDNAにおける優先鎖切断修復を研究した。

誘発された損傷の修復の速度論を研究することは、遺伝毒性化学物質に対する細胞応答の理解に役立つでしょう。さらに、（抗）発癌プロセスにおけるプレーヤーとしてのDNA修復の意義は、特定の癌標的組織のレベルでの修復を見ることによって解明することができる。修復の調節（および遺伝毒性化合物に対する細胞応答の他の側面）は、エピジェネティックなメカニズムを含む可能性が高く、cometアッセイは、様々な増殖条件下, 2014).

尾部のDNAは、参照される彗星や損傷の程度を容易に視覚化できるため、DNA破断頻度の最良の記述子として推奨されています。しかし、多くの研究者は依然として尾モーメントの使用を好む（Møller et al., 2014). 実際には、２つの記述子は、アッセイ条件によって同様に影響される（Ａｚｑｕｅｔａｅｔａｌ．ることを示した。

彗星アッセイの変動は、異なるプロトコルの使用から生じるか、制御不能またはランダムな実験変動から生じるかにかかわらず、重要な問題です。すべての実験に参照標準を含めることは、特に、例えばバイオモニタリング試験からの多数のサンプルが異なる機会に分析される場合に推奨される。参照標準は、既知の量のDNA損傷を有する細胞である; 未処理の細胞（陰性対照）、Ｘ線曝露細胞（陽性対照）、または光増感剤プラス光で処理した細胞（ＦＰＧインキュベーションを含むアッセイのための陽性対照）のいずれかで、バッチ調製され、アリコートとして凍結される。実験の実行中に標準に実質的な変動が生じた場合、試料の結果を正規化することができる（Collins et al., 2014). 実験室間で参照標準を交換すれば、これらの実験室からの結果はより容易に比較することができる。

参照標準セルは、通常、サンプルゲルと並行してゲルに設定されています。内部標準-すなわちサンプル細胞と同じゲル内の標準細胞—が理想的であろうが、それは細胞の二つのタイプを区別することができることはもちろん不可欠です。ヒト細胞と比較してゲノムサイズが大きいかまたは小さい魚細胞が、この目的のために成功裏に採用されている（Ｂｒｕｎｂｏｒｇｅｔａｌ．, 2015). これらの参照細胞は、標準または検量線（異なる線量の電離放射線を与えられた細胞で確立された）と組み合わせて使用することができ、％tail DNAではなくDNA break frequencyとして表現されたDNA病変のより正確な定量を可能にする。

統計は、偶然に小さな違いが発生するかどうかを確認するために、cometアッセイのすべてのアプリケーションにおいて重要なツールです。統計分析の簡潔な説明および試験のための推奨が公表されている（Ｌｏｖｅｌｌｅｔａｌ． 1999年、ラヴェルと大森、2008年）。 Møller and Loft(2014)は、comet assayの統計分析を単純に保つために、実験を計画する際に適切な研究設計と統計的パワーを慎重に考慮する必要があることを思い出させます。

すべての生物学的アッセイと同様に、コメットアッセイの結果をより大きな画像内で解釈するためには、データ統合が重要です。彗星アッセイによって提供される情報と、他のＤＮＡ損傷指標および細胞応答（例えば、酸化ストレス、細胞分裂、または細胞死）との統合は、ＥＲＡの両方に適用さら、２０１４；Ｓａｎｔｏｓｅｔａｌ．ら、２０１５）ならびにヒト（生体モニタリング）研究（例えば、Ｌａｎｇｉｅｅｔａｌ．ら、２０１０；Ｓｌｙｓｋｏｖａｅｔａｌ．, 2012). また、「オミックス」データを含めることは、遺伝毒性化合物の作用様式を解明するのに役立つであろう（Slyskova et al., 2012, 2014; サントス他いくつかの研究では、DNA修復の表現型の尺度が必ずしもゲノムまたは転写データと相関しないことが示されている（Collins et al.,2015）— ら、２０１２；Ｓｌｙｓｋｏｖａｅｔａｌ．,2012,2014);異なるアプローチは相補的とみなされるべきである。

30年の開発と修正を経ても、コメットアッセイは依然としてかなり単純で汎用性が高いが労働集約的なアッセイである。アッセイの種々の高スループット修飾が最近レビューされた（Ｂｒｕｎｂｏｒｇｅｔａｌ．, 2014). In vivoおよびin vitroの適用は両方効率、議定書の標準化、および効率のそれ以上の改善からの大きい利点を得る。自動化と小型化は、生物学の多くの分野で一般的な戦略であり、実験ごとに分析されたサンプル数の桁違いの変化を可能にし、主観的バイアスを低減し、再現性を向上させる。

だから、次の30年間で何を望むことができるのだろうか？遺伝子毒性試験のためのin vitro cometアッセイの受け入れ、無限の顕微鏡観察から研究者を救うための安価な自動化されたcometスコアリング、プロトコル標準化（おそらく）と信頼性の高い内部参照標準、DNA修復のより多くのヒトバイオモニタリング研究（表現型アッセイはゲノミクスとトランスクリプトミクスと並んで重要な場所を持っていることを受け入れる）、様々な動物や植物種を用いた環境モニタリング、およびより多くの予測不可能な開発と応用。

利益相反に関する声明

著者らは、本研究は、利益相反の可能性があると解釈される可能性のある商業的または財政的関係がない場合に行われた

謝辞

このフロンティアの研究テーマに貢献したすべての著者、レビュアー、編集者に感謝したいと思います。 SLは、AXA Research FundおよびCefic-LRI Innovative Science Award2013のポスドク補助金の受益者です。 AAは個人的なサポートのためのスペイン政府のMinisterio de Economía y Competitividad（’Ramón y Cajal’プログラム、2013）に感謝します。ることができると考えられている。ナノ材料の遺伝毒性の評価のためのコメットアッセイの使用。フロントジュネット 6:239. ドイ:10.3389/fgene.2015.00239