Kollagensynthese
Regulation der Knochenkollagensynthese
Die Kollagensynthese in Organkulturen von Nagetierkalvariae und Zellkulturen wurde mit verschiedenen Assays untersucht . Im am weitesten verbreiteten Assay werden Calvariae und Zellen vor dem Ende der Kultur mehrere Stunden mit radioaktiv markiertem Prolin inkubiert. Der Einbau von radioaktiv markiertem Prolin in Kollagenase-verdauliches Protein (CDP-Markierung) und Nicht-Kollagenprotein (NCP-Markierung) wird in Extrakten der Kulturen mit hochgereinigter bakterieller Kollagenase gemessen. Die prozentuale Kollagensynthese wird aus den CDP- und NCP-Werten berechnet, nachdem die größere Häufigkeit von Prolin in Kollagen im Vergleich zu Nichtkollagenproteinen korrigiert wurde . Die Kollagenproduktion kann auch durch Messung des Hydroxyprolingehalts von Zell- oder Organkulturen bestimmt werden, da Hydroxyprolin praktisch einzigartig für Kollagene ist. Diese Methoden unterscheiden nicht zwischen verschiedenen Arten von fibrillärem Kollagen. Das von Knochenorgankulturen und den meisten osteoblastischen Zellkulturen synthetisierte Kollagen ist jedoch weitgehend vom Typ I (> 95%), so dass der CDP-Markierungswert normalerweise die Kollagensynthese vom Typ I widerspiegelt. Falls gewünscht, kann die Herstellung verschiedener Kollagentypen durch Ionenaustauschchromatographie und Polyacrylamidgelelektrophorese von radioaktiv markierten Extrakten von Zell- oder Organkulturen unterschieden werden . Die Typ-I-Kollagenexpression in menschlichen Zellkulturen wurde auch durch Messung der Sekretion des C-terminalen Prokollagen-I-Propeptids bewertet . Schließlich wurden spezifische cDNA-Sonden im Northern-Blotting und allelspezifische Primer in Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktionstests verwendet, um die Kollagen-mRNA-Expression in Knochenmodellen zu bewerten. Die Messung der Wirkung von 1,25 (OH) 2D3 auf die Kollagensynthese und die mRNA-Spiegel ergab vergleichbare Ergebnisse unter Verwendung dieser verschiedenen Assays.
1,25(OH)2D3 hemmt die Kollagensynthese in Organkulturen von 21-tägigen fetalen Ratten-Calvariae und neonatalen Maus-Calvariae mit geringer oder keiner Wirkung auf die Nicht-Kollagenproteinsynthese. Die maximale Hemmung der Kollagensynthese durch 1,25 (OH) 2D3 in Rattenkalvariae (etwa 50%) tritt bei 10 nM auf . 1,24R,25- (OH) 3D3 hemmt auch die Kollagensynthese, ist jedoch weniger wirksam als 1,25 (OH) 2D3 . 25- (OH) D3 und 24R,25 (OH) 2D3 verändern die Kollagensynthese unter 100 nM nicht. Vitamin-D-Metaboliten hemmen die Kollagensynthese und stimulieren die Resorption von fötalen Rattenlängsknochen mit ähnlichen relativen Potenzen, die mit der Affinität der Metaboliten für die skelettalen VDRs korrelieren . Zur Bestimmung der Zellselektivität der 1,25(OH)2D3-Hemmung der Kollagensynthese wurden Organkulturen von fetalen Rattenkalvariae 22 h lang mit 1,25(OH)2D3 behandelt und anschließend für die letzten 2 h der Kultur mit tritiiertem Prolin inkubiert. Der zentrale Knochen (reife Osteoblasten) wurde frei vom Periost (weniger reife Osteoprogenitoren und Fibroblasten) präpariert und beide Kompartimente wurden getrennt auf den Einbau von tritiiertem Prolin analysiert. 1,25 (OH) 2D3 verringert die Kollagensynthese im zentralen Knochen, jedoch nicht im Periost, was auf eine Selektivität des 1,25 (OH) 2D3-Effekts für reife Osteoblasten hinweist . Unter Verwendung eines In-vivo-Protokolls, bei dem neugeborenen Ratten mehrere Injektionen von tritiiertem Prolin verabreicht wurden, um neu synthetisierte Knochenmatrix zu radiomarkieren, hemmten 25 ng 1,25 (OH) 2D3, die an den Tagen 1, 3 und 5 verabreicht wurden, die Knochenmatrix Synthese, wie durch Histomorphometrie von Autoradiographien von Tibia und Calvariae beurteilt .
1,25(OH)2D3 hemmt auch die Kollagenproduktion in Osteosarkom-ROS-17/2,8-Zellen von Ratten, primären Osteoblastenzellen von Ratten und Mäusen und einer immortalisierten Osteoblasten-Zelllinie von Mäusen (MMB-1) . 1,25 (OH) 2D3 hat eine größere hemmende Wirkung auf die Typ-I-Kollagensynthese während des Log-Phasenwachstums von primären murinen osteoblastischen Zellen als bei der Konfluenz, möglicherweise weil proliferierende Zellen mehr VDRs enthielten . Ebenso ist die 1,25 (OH) 2D3-Hemmung der Kollagensynthese in spärlichen Kulturen von MMB-1-Zellen größer, die höhere VDR-Spiegel aufweisen als konfluente MMB-1-Zellen . Die 1,25 (OH) 2D3-Hemmung der Kollagensynthese ist in spärlichen und konfluenten primären osteoblastischen Rattenzellen äquivalent , aber die VDR-Zahl änderte sich während des Wachstums der Zellen nicht . Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass das Ausmaß der Hemmung der Kollagensynthese durch 1,25 (OH) 2D3 weitgehend durch die zelluläre Menge an VDRs bestimmt wird. 1,25 (OH) 2D3 hemmt die Kollagen-mRNA-Spiegel während der Proliferationsphase von Langzeitkulturen primärer Osteoblastenzellen von Ratten und verhindert die Bildung mineralisierter Knochenknoten durch diese Kulturen . Diese Studien zeigen, dass 1,25 (OH) 2D3 die Differenzierung von Osteoprogenitoren hemmt, die mineralisierte Knötchen in primären osteoblastischen Zellkulturen der Ratte bilden . Die Hemmung der Knötchenbildung durch 1,25 (OH) 2D3 kann jedoch sekundär zur Unterdrückung der Kollagensynthese vom Typ I in den Kulturen sein.
Im Gegensatz zu den oben beschriebenen inhibitorischen Effekten stimuliert 1,25 (OH)2D3 transient die Kollagen- und Nichtkollagenproteinsynthese (etwa zweifach), die zwischen 12 und 24 h ihren Höhepunkt erreicht, in der immortalisierten murinen Osteoblastenzelllinie MC3T3-E1 . In dieser Studie wurde der prozentuale Anteil des von den Kulturen synthetisierten Kollagens (Kollagen im Verhältnis zur Gesamtproteinsynthese) nicht angegeben; infolgedessen war es nicht möglich, die Selektivität des 1,25 (OH) 2D3-Effekts für die Kollagensynthese zu bestimmen. 1,25 (OH) 2D3 erhöht auch die Kollagenexpression in der humanen osteoblastischen Osteosarkomzelllinie MG-63 und Primärkulturen humaner osteoblastischer Zellen . Interessanterweise wird der Anstieg der Kollagensynthese durch 1,25 (OH) 2D3 in MG63-Zellen durch das insulinähnliche Wachstumsfaktor-Bindungsprotein 5 blockiert, das direkt mit dem VDR interagiert und die Heterodimerisierung mit dem Retinoid-X-Rezeptor RXR verhindert . In anderen Studien wurde jedoch gezeigt, dass 1,25 (OH) 2D3 die prozentuale Kollagensynthese in MC3T3-E1-Zellen verringert . MC3T3-E1 und MG-63 stellen präosteoblastische Zellen dar, die sich in vitro einer osteogenen Differenzierung mit Ascorbinsäure unterziehen; 1,25 (OH) 2D3 hemmt das Zellwachstum und erhöht die Osteocalcinexpression und die Aktivität der alkalischen Phosphatase in beiden Zelllinien. MC3T3E1-Zellen zeigen, wie die meisten immortalisierten osteoblastischen Zelllinien, eine signifikante phänotypische Variation . Daher können einige dieser abweichenden Ergebnisse auf Variationen in den für die Experimente verwendeten Zellen zurückzuführen sein. Zusammenfassend deuten diese Daten darauf hin, dass 1,25 (OH) 2D3 in frühen Zellen der Osteoblasten-Linie als differenzierendes Hormon wirken kann, was zu einer erhöhten Typ-I-Kollagenexpression führt. Im Gegensatz dazu hemmt 1,25 (OH) 2D3 die Typ-I-Kollagenexpression in reifen Osteoblasten.
